沙丁鱼血管紧张素转化酶抑制肽的制备、分离纯化及功效研究

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沙丁鱼(Sardina melamosticta)是我国东南沿海重要的鱼类资源之一。其显著特点是:产量高、繁殖快、价格低廉,是一类具有很大开发潜力的鱼类资源。本文以沙丁鱼为原料,通过酶解的方法制备沙丁鱼辅助降血压肽,并进行了成分分析和体内功效研究。首先,利用不同的酶解组合对沙丁鱼肉进行酶解,以血管紧张素转化酶(ACE)抑制率为指标,筛选出最佳的酶解组合,并对酶解工艺进行了优化;然后,采用超滤、柱层析的方法对酶解液进行分离纯化,所得ACE抑制活性较强的组分进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)和氨基酸组成分析;最后,选用原发性高血压大鼠(SHR)和正常血压的京都大鼠(WKY),对酶解液的体内降血压功效及生理生化影响进行了测定。研究结果如下:1)最佳酶解组合:木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶。最佳酶解工艺:用木瓜蛋白酶进行第一步酶解,反应温度65°C、pH 7.5、反应时间2.25h、酶添加量4000U/g、料液比30%(W/V);用碱性蛋白酶进行第二步酶解,反应温度65°C、pH 10.0、反应时间2.0h、酶添加量5000U/g。工艺优化后,沙丁鱼蛋白的水解度(DH)从16.70%提高到28.44%,其酶解液(C=20.0mg/m L)的ACE抑制率则从65.40%提高到73.44%。2)超滤后,得到分子量小于5kDa的透过液。再经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25和G-15两步柱层析,最终得到3个ACE抑制活性较强的组分P2-1、P2-2和P3-2(C=1.0mg/mL),其ACE抑制率分别为69.48%、70.42%和75.43%。根据P2-1、P2-2和P3-2的RP-HPLC和氨基酸组成分析结果,推测ACE抑制活性的强弱与其氨基酸组成和疏水性强弱有关。3)单次灌胃后沙丁鱼ACE抑制肽后,SHR的收缩压(SBP)出现一定程度的下降(P<0.01、P<0.05或P>0.05),但不能保持稳定。经连续4周期灌胃后,SHR的SBP下降明显(P<0.05或P<0.01),并能保持稳定。测定两种大鼠的脏器系数、组织及血清丙二醛(MDA)、血清ACE活力和血管紧张素II(ANG-II)浓度,发现酶解液仅对SHR产生显著的生理生化影响(P<0.01或P<0.05),而不会对WKY大鼠的生理生化指标产生明显影响(P>0.05)。此外,灌胃化学合成降压药卡托普利,会影响WKY的SBP及部分生理生化指标(P<0.01、P<0.05或P>0.05)。以沙丁鱼为原料开发辅助降血压功能食品,制得的产品活性较强,且未发现安全性问题和化学类降压药的副作用,具有很大的开发价值和应用前景。
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