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近年来,果树病毒病在全世界广泛发生流行,造成水果产业的产量和品质严重下降,甚至带来毁灭性的经济损失。其中,引起苹果茎痘病的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和引起苹果茎沟病的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving Virus,ASGV)是果树病毒病中两种非常重要的病毒。果树一旦感染病毒则终生带毒,且无药剂可防治,所以建立病毒的检测技术和监控体系是果树病毒病防控的关键。血清学方法具有操作简单、快速、灵敏、高通量等优点,是果树病毒检测和调查最实用的方法。鉴于目前我国还没有建立ASPV和ASGV这两种病毒的血清学检测技术的现状,本论文利用杂交瘤技术分别制备了 ASPV和ASGV的单克隆抗体,并以制备单抗为核心分别建立这两种病毒的特异、灵敏的血清学检测技术,从为这两种病毒的果园诊断和检测、流行病学研究和科学防控体系建立提供物质和技术支撑。1.ASPV的单抗制备及其血清学检测技术:将ASPV梨分离物的外壳蛋白基因(CP)用原核表达载体pET-28a在大肠杆菌中进行表达,并用Ni2+-NTAagarose胶纯化,纯化蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合、筛选和克隆后获得4株分泌抗ASPV单抗的杂交瘤细胞株(2H2,14C3,20G6和20F9)4株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达10-6,抗体类型及亚型为IgG1、κ链。Western blot分析表明,4株单抗均能与ASPV重组外壳蛋白和感染ASPV的梨树病叶中的病毒衣壳蛋白发生特异性免疫反应,不与感染ASGV、ACLSV和感染ASPV苹果分离物的苹果病叶和健康果树叶片发生免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASPV的dot-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA方法,它们的检测感染ASPV梨病叶粗提液的灵敏度分别达到了 1:1,280、1:10,240和1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。应用建立的血清学方法对采自湖北武汉、北京和陕西西安和浙江杭州的168份疑似病毒病样品进行检测,结果发现用血清学方法检测到共有96份样品感染ASPV,且血清学方法的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率达到94.8～96.9%,说明建立的血清学方法能有效、准确地检测梨树中的ASPV,且该病毒在我国果园发生普遍。ASPV单抗的制备及其血清学检测技术的建立对我国ASPV梨分离物的检测、诊断和防控具有重要意义。2.ASGV的单抗制备及其血清学检测技术:利用大肠杆菌原核表达的ASGV外壳蛋白作为抗原免疫小鼠和兔子,制备了两株抗ASGV的特异性单抗(9B10和19B10)和1个ASGV CP蛋白的兔多抗。9B10和19B10单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7。2株单抗的抗体类型及亚型均为IgG1、κ链。单抗的特异性分析发现,2株单抗均能与感染ASGV果树病叶和重组表达的ASGV CP蛋白发生特异性免疫反应,而不与感染ASPV和ACLSV的果树病叶组织、健康苹果、梨树和柑橘的叶片组织粗提液发生任何免疫反应。以单抗为核心建立了检测ASGV的dot-ELISA和TAS-ELISA两种血清学方法。其中dot-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶粗提液的灵敏度达到了 1:640倍稀释,检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:2,560倍稀释(w/v,g/ml),而TAS-ELISA方法检测感染ASGV苹果和梨病叶的灵敏度达到了 1:5,120倍稀释(w/v,g/ml),检测感染ASGV柑橘病叶的灵敏度达到1:10,240倍稀释(w/v,g/ml)。对采自湖北、陕西、北京、浙江各地的187份疑似果树病叶样品进行血清学方法的检测,共检测到79份样品显示ASGV阳性,且dot-ELISA和TAS-ELISA的检测结果和RT-PCR的结果符合率达到96.3%以上,说明建立的检测ASGV的血清学方法能有效、准确地检测果树中的ASGV。ASGV单抗的制备及其血清学技术的建立为我国ASGV的诊断和检测、流行病学研究和无毒种苗的生产提供技术支撑。