细菌和真菌感染是临床常见的感染性疾病,发病率和死亡率高,如果得不到早期的诊断和治疗,会严重危及患者的生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法,缺乏敏感性和特异性,不能早期快速的诊断病原菌感染,因此,寻找快速的诊断方法至关重要。在本研究中,我们建立了分子生物学方法,用于临床感染中常见细菌和真菌的快速诊断,指导临床合理应用抗生素。第一部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的建立目的：建立同时检测和鉴别革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌的TaqMan探针法荧光定量PCR,早期快速的诊断致病菌感染。方法：在GenBank数据库中查找20种细菌的16S rRNA基因序列和7种真菌的18SrRNA基因序列,应用ClustalX软件比对序列,找出各自的保守序列。使用Primer Express2.0和Oligo6.0软件,按照引物和探针设计的一般原则,在细菌的保守区筛选出细菌的通用引物和革兰分型探针,在真菌的保守区筛选真菌的通用引物和通用探针。革兰阳性探针和真菌探针的5’端标记荧光报告集团FAM,革兰阴性探针的5’端标记荧光报告集团HEX,它们的3’端均标记TAMRA荧光淬火基团。细菌的扩增片段长度为229bp,真菌的扩增片段长度为276bp,引物和探针均在Invitrogen公司合成。优化荧光定量PCR反应体系,细菌的两个分型探针在同一个管中,真菌的探针在单独的管中,即同一个模板进行细菌和真菌的平行反应,每次反应均设置阳性对照、阴性对照和无模板的空白对照,所有反应均在ABI7500荧光定量PCR仪器上进行。检测11种革兰阳性细菌、9种革兰阴性细菌和7种真菌的标准菌株或者临床分离菌株,同时检测乙肝病毒DNA和人的基因组DNA,以观察所建立方法的特异性。使用标准菌株金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌、白色念珠菌进行普通PCR,分别构建阳性克隆质粒,定量后进行十倍的梯度稀释,调整质粒浓度为108copies/μl～100opies/μ1。按照建立的反应条件用通用引物和特异性的探针进行荧光定量PCR,每个浓度做3次重复,评价方法的敏感性和线性关系。同时选取白色念珠菌3个不同浓度的定量标准质粒,连续三天进行重复检测,每次做三个复孔,通过计算其CT值的变异系数进行重复性和稳定性的评价。结果：用所设计的引物和探针检测20种细菌和7种真菌,11种革兰阳性菌在革兰阳性探针通道均有扩增曲线,在革兰阴性探针和真菌探针通道均无扩增曲线,9种革兰阴性菌在革兰阳性探针和真菌探针通道无扩增曲线,在革兰阴性探针通道有明显的扩增曲线。使用细菌菌株DNA、病毒DNA和人基因组DNA作为模板,加入真菌的通用引物和通用探针,检测结果均是阴性,真菌菌株仅能被真菌探针检测到,CT值从15.6到26.0,说明所设计的引物和探针均是特异性的。对构建的三种菌的质粒使用无菌去离子水进行十倍的梯度稀释,使用建立的方法进行检测,结果显示三种质粒在108～101copies范围内都有很好的线性关系。如果反应体系中仅加入细菌的两个探针,以CT值35为界限,最低可以检测出金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌10个拷贝的质粒DNA。如果三个探针同时加入反应体系,最低可检测出102个拷贝的质粒DNA。真菌的107拷贝、105拷贝和103拷贝数的批间变异系数分别为2.47%、1.89%和2.28%,均小于5%,说明本实验建立的方法重复性和稳定性较好。结论：本研究建立的多重荧光定量PCR方法,在单个样本中可以同时检测和鉴别细菌和真菌感染,敏感性高、特异性强,使用三个探针即可区分出革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌感染,可以快速应用于临床实验室诊断,为感染性疾病的早期诊断提供了重要依据。第二部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的临床应用目的：评价所建立的荧光定量PCR方法检测临床标本的应用价值。方法：每份脑脊液标本的一部分进行3000rpm离心10分钟,上清接种肉汤增菌,沉淀接种于巧克力平板、血平板和真菌显色平板,在5%的CO2培养箱中37℃培养过夜。临床怀疑隐球菌感染的标本同时进行墨汁染色,在检验科常规室同时进行脑脊液常规分析。提取137份脑脊液标本的DNA,用建立的荧光定量PCR方法进行检测,并与培养方法和印度墨汁染色进行比较,结果使用>PSS13.0进行分析,统计使用x2检验即McNemar检验。结果：在137份脑脊液标本中,以CT值35为检测限,共有23例标本PCR检测为阳性,包括7份细菌阳性和16份隐球菌阳性,阳性率为16.8%。由于临床患者很多已经应用抗生素治疗,而且营养要求较高的菌很难培养出阳性,脑脊液细菌培养仅仅有4例标本阳性；而墨汁染色方法对专业技术人员的要求比较高,敏感性差,墨汁染色有10例阳性。以培养法和墨汁染色作为对照方法,PCR方法检测脑脊液样本的阳性率高于传统的对照方法,两者经统计分析有显著性差异(χ2=5.82,P=0.012)。检测的灵敏度为92.86%,检测特异度为91.87%,约登指数为0.8473。结论：建立的荧光定量PCR方法用于临床标本的检测,操作简单,不仅应用于脑脊液感染的诊断,还可以应用于血液、胸腹水、尿液等体液标本,可以作为培养法的辅助于段,为临床医生早期用药提供依据。第三部分荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因方法的建立目的：建立检测新型隐球菌荚膜相关蛋白基因的荧光定量PCR方法,为新型隐球菌的早期诊断和疗效判断提供重要方法。方法：在GenBank数据库中查找新型隐球菌荚膜相关蛋白基因的序列,使用Primer Premier5.0软件设计一对引物,提取菌株的RNA并进行逆转录。PCR扩增CAP10基因的cDNA片段,目的片段长度为191bp,回收产物克隆至pMD18-T载体,转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建质粒标准品,定量后进行十倍的梯度稀释；建立荧光定量PCR反应体系,分析扩增曲线和融解曲线,并评价方法的敏感性、特异性和重复性。结果：建立的荧光定量PCR方法检测荚膜相关蛋白基因CAP10质粒的敏感性为6.8×101copies,方法的特异性好,对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌均无扩增反应。检测同一个浓度的质粒,批内变异系数为0.65%,批间变异系数为2.45%,说明具有很好的重复性。结论：成功建立了荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因的方法,该方法重复性好,敏感性和特异性高,可用于新型隐球菌的早期诊断,也可用于脑膜炎预后的监测及疗效观察。第四部分LAMP技术检测幽门螺杆菌方法的建立及初步应用目的：建立一种快速简单的检测幽门螺杆菌的方法,为探索临床常见的其他细菌和真菌的诊断方法奠定基础。方法：在GenBank数据库中查找幽门螺杆菌的16S rRNA基因序列,使用在线软件Primer Explorer4.0设计一套引物,包括外引物F3和B3,内引物FIP和BIP,使用Primer Premier5.0设计一对PCR引物,优化反应条件,建立LAMP和普通PCR反应体系,比较两种方法检测幽门螺杆菌的敏感性和特异性,并评价了LAMP方法检测粪便模拟标本的敏感性。结果：使用LAMP方法可以在2小时内得到检测结果,加入核酸染料后阳性管为绿色,电泳后有明显的阶梯状条带。LAMP方法检测幽门螺杆菌的基因组DNA的敏感性为12pg,是普通PCR的10倍,对模拟粪便标本进行检测,检测敏感性为102CFU/ml;两种方法的特异性良好,均未检测出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。结论：成功建立了环介导等温扩增技术检测幽门螺杆菌的方法,敏感性高、特异性强,操作简单,不需要特殊仪器和设备,是一种很有前景的检测方法。