研究目的:作为人体最大的实质性器官,肝脏承担代谢、解毒功能,在机体的循环系统内发挥重要作用。由于其结构及功能的特殊性,使得肝脏成为机体最早、最常接触病原体等异源物质的器官。正常生理状态下,肝脏可选择性忽略上述异源物质,以维持自身的稳态。但是,当肝脏长期处于高载量的病菌毒素及自身抗原的微环境中时,会打乱肝脏的免疫稳态,形成长期的炎症微环境,造成肝损伤。长期的肝脏损伤一方面会进一步发展为肝硬化、肝坏死,另一方面这种变化作用于机体的免疫系统,将增强免疫耐受,导致机体无法识别、杀伤变异的细胞,形成恶性循环,最终发展为肝癌。作为免疫系统的重要成员,T细胞在病变过程中对于清除病原体及微生物而言至关重要。当T细胞被激活后,通过CTL机制直接杀伤感染细胞或是通过分泌细胞因子有效清除异物;但是,如果T细胞长期暴露于慢性感染或炎症环境中,其抗原载量超负荷,则无法有效行使功能。多种因素可以造成T细胞功能耗竭,包括抗免疫抑制因子、免疫负调细胞以及免疫抑制微环境。由于T细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用,对于T细胞耗竭机制的探讨也越来越受到关注,但是,肝癌中T细胞的耗竭机制尚不十分清楚。作为肿瘤相关基质细胞中重要的组成部分,肿瘤相关的巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用。在早期炎症时期,可通过分泌IL-12及IL-1β等相关炎性分子促进NK细胞及T细胞的功能,增强机体的免疫力,抵抗肿瘤发展;在癌症晚期阶段,巨噬细胞又可极化为M2型巨噬细胞,通过分泌TGF-β、IL-6等抑制性因子,促血管生成,形成免疫抑制微环境,最终诱导肿瘤增殖及转移。但是,在肝癌发展过程中,巨噬细胞的极化表型是如何转化的,又是如何作用于其它细胞如T细胞而影响肝脏免疫微环境的,这些问题尚未完全阐述。外泌体是细胞外纳米级的囊泡状物质,可由正常细胞、癌变细胞,实质细胞、免疫细胞等分泌,可作为细胞间传递物质的重要介质。研究表明,肿瘤来源的外泌体能通过重塑肿瘤的微环境影响肿瘤的进程。但是,肝癌细胞来源的外泌体是否对微环境中主要成员-巨噬细胞及T细胞功能产生影响尚不清楚。我们推测肝癌细胞来源的外泌体可重塑微环境中的巨噬细胞,并进一步影响效应细胞的功能,促进肿瘤的发展。该研究旨在明确肝癌细胞来源的外泌体是如何调控巨噬细胞及T细胞的功能,并进一步深入揭示外泌体中何种成分调控巨噬细胞极化,发现肝癌发生发展的新的免疫学分子机制。研究方法:1.通过腹腔注射DEN/CCl4的方式,建立小鼠原发性肝癌模型。通过对健康小鼠及肝癌小鼠的体重、肝重、免疫细胞数量的检测,判断小鼠发生肝癌的情况。2.分离提取小鼠肝脏的免疫细胞,流式细胞术(FACS)检测健康小鼠与肝癌小鼠肝脏中各免疫细胞亚群细胞比例,包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞及MDSC细胞比例的差异。检测T细胞、NK细胞及NKT细胞表面抑制性受体(Tim-3、TIGIT、CTLA4、PD-1、LAG-3、BTLA4)的表达水平和细胞功能性分子(IL-2、TNF-α IFN-γ、NKG2D、FasL)的表达水平。3.分离提取小鼠肝脏肝实质细胞,流式细胞术(FACS)检测健康小鼠与肝癌小鼠肝脏实质细胞的免疫相关分子的表达。4.分选小鼠脾脏naive T细胞,体外使用DEN/CCl4诱导,流式细胞术检测细胞表面抑制性受体的表达变化。5.使用梯度离心法提取肝癌细胞系培养上清、小鼠血清及人外周血血清中的外泌体。通过透射电子显微镜、Western blot及动态光散射法对外泌体的形态、标志及粒径大小和分布情况进行检测。6.提取小鼠腹腔巨噬细胞,通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞对外泌体的摄取情况,确定巨噬细胞对外泌体的摄取能力。7.Western blot及定量PCR检测外泌体“教育”后的巨噬细胞的炎性因子表达。8.通过MTT增殖实验及Transwell技术检测外泌体“教育”后巨噬细胞的上清对Hepal-6细胞的增殖及迁移能力的影响。9.通过Transwell技术及流式细胞术(FACS)检测外泌体“教育”后的巨噬细胞上清对脾脏单个核细胞的趋化作用。10.使用流式细胞术、荧光定量PCR、ELISA及免疫荧光技术对外泌体“教育”后的巨噬细胞的极化标志CD206、CCL17、CCL22、ARG-1及ROS的表达情况进行检测。11.采用Western blot及FACS检测外泌体“教育”后的巨噬细胞极化相关的信号通路,包括STAT3及STAT1,确定巨噬细胞的极化情况。12.采用流式细胞术检测外泌体“教育”后的巨噬细胞表面的抑制性分子(CD169)及抑制性受体的配体(MHC-II、PD-L1、CD80),确定巨噬细胞的功能。13.采用磁珠分选法分选健康小鼠肝脏及脾脏T细胞,与外泌体“教育”后的巨噬细胞共孵育,流式细胞术检测T细胞表面抑制性受体的表达及细胞因子的分泌。14.提取小鼠骨髓细胞,使用M-CSF诱导分化成巨噬细胞(BMDM),使用流式细胞术对诱导分化的巨噬细胞进行鉴定。15.使用氯磷酸二钠脂质体清除巨噬细胞并转输经外泌体“教育”后BMDM,检测转输后5天的小鼠肝脏T细胞表面抑制性受体的表达、细胞因子的分泌、细胞增殖及对肿瘤细胞的杀伤能力,进一步确定外泌体“教育”后的巨噬细胞对T细胞功能的影响。16.利用LipofectamineTM 2000转染体系干预肝癌细胞内miR-146a-5p、SALL4的表达,利用定量PCR技术检测肿瘤细胞及细胞培养上清外泌体内微小RNA的含量。17.利用尾静脉高压注射技术对小鼠肝脏细胞SALL4的表达进行干预,并通过Western blot、免疫组化、免疫荧光等方式验证沉默效果。通过定量PCR检测技术对健康小鼠、肝癌小鼠、阻断肝细胞内SALL4的肝癌小鼠肝细胞内恶性增殖相关基因进行检测,确定SALL4分子在肝癌中的作用。使用H&E染色方法对肝癌小鼠的肝脏损伤情况进行检测。18.使用ChIP实验方法对SALL4与miR-146a-5p启动子区域的结合进行检测。19.使用荧光素酶报告基因方法检测SALL4对miR-146a-5p转录活性的调控。研究结果:1.小鼠原发性肝癌模型建立健康小鼠经腹腔注射DEN 3次、CCl4 12次诱发小鼠肝脏癌症。通过对小鼠体重、肝重检测发现,肝癌小鼠体重明显降低,并随肝癌进程的加重肝脏肿大,肝细胞表面免疫相关分子表达异常,肝脏中各免疫细胞比例发生改变,提示肝脏免疫微环境发生紊乱。2.肝癌组织中T细胞功能耗竭对肝脏T细胞、NK细胞、NKT细胞表面抑制性受体及其分泌细胞因子检测发现,T细胞表面的抑制性受体异常高表达,细胞功能性分子明显下调,T细胞处于明显的功能耗竭状态;NKT细胞的表面抑制性受体表达上调,但细胞的功能仍较强,表现为细胞因子分泌增多;NK细胞表面的抑制性受体变化不明显,并且细胞功能也较强。这些现象提示,肝癌状态下,主要是肝脏T细胞发生耗竭。我们通过体外诱导实验发现,DEN/CCl4对T细胞的耗竭表型并无直接影响,推测可能是肝癌细胞形成的微环境对T细胞的耗竭产生影响。3.巨噬细胞可摄取肝癌细胞分泌的外泌体梯度离心法提取肝癌细胞培养上清中的外泌体,并通过透射电镜检测发现外泌体的膜结构良好,并为CD63及CD81阳性,粒径为30-150 nm之间,分散度良好。使用DID进行标记,并与标记Hochest的巨噬细胞共孵育,共聚焦显微镜进行观察。结果显示,共孵育15分钟后,外泌体已附着在巨噬细胞表面;孵育30分钟后,外泌体可被巨噬细胞摄取,进入细胞中。4.肝癌细胞外泌体促进巨噬细胞活化,加速肿瘤的增殖及迁移肝癌细胞外泌体孵育巨噬细胞24 h后,诱导巨噬细胞产生更多的炎性因子,包括TNF-α及IL-1β。为探究孵育后的巨噬细胞对肿瘤细胞的作用,我们收取肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞24 h内分泌的上清,并将上清与完全培养基以1:1的比例孵育肝癌细胞,在24、48、72 h时检测肝癌细胞的增殖。我们发现,经肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞上清均能刺激肝癌细胞的增殖和迁移。因此,肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞分泌的上清对肝癌的发展有促进作用。5.肝癌细胞外泌体促进巨噬细胞向M2型极化肝癌细胞外泌体孵育巨噬细胞后,可使巨噬细胞极化表型发生该变。来自肝癌细胞培养上清的外泌体或是肝癌小鼠血清中的外泌体均可使巨噬细胞向M2型极化,使细胞表面CD206分子表达上调,趋化Th2型细胞相关的趋化因子CCL17、CCL22表达增多;细胞可产生更多的精氨酸酶(ARG-1),促进细胞的分裂。同时,细胞杀伤功能降低,表现为细胞的ROS合成减少。细胞向M1型极化的STAT1信号通路受到抑制,向M2型极化的STAT3通路活化,说明肝癌细胞外泌体可通过影响细胞内的信号通路,干预细胞表面分子、细胞相关因子的表达谱,影响巨噬细胞的极化方向。6.肝癌细胞外泌体“教育”巨噬细胞呈现免疫抑制功能肝癌细胞外泌体“教育”巨噬细胞后,不仅可重塑巨噬细胞的极化方向,还可影响巨噬细胞的免疫功能。检测发现,肝癌细胞外泌体孵育后的巨噬细胞表面与抑制性功能相关的CD169分子表达上调,细胞呈现抑制功能;同时,细胞表面的抑制性受体的配体MHC-II、PD-L1、CD80等表达升高。该结果说明,巨噬细胞被肝癌细胞外泌体孵育后呈现免疫抑制功能,在自身细胞抗肿瘤功能降低的同时还可通过细胞表面分子影响其他细胞功能。7.肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞抑制T细胞功能我们通过体外实验证实,肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞可抑制T细胞的功能,使细胞表面的抑制性受体TIGIT、PD-1、CTLA4表达上调,细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α细胞因子的能力降低,共孵育后的T细胞呈现细胞耗竭状态。体内实验也得到同样的结果,我们将肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞转输到已清除巨噬细胞的小鼠体内,检测肝脏T细胞的功能。结果显示,T细胞表面抑制性受体TIGIT、Tim-3表达上调,细胞分泌细胞因子IL-2、TNF-α的能力降低;同时,我们将T细胞分选后发现,经与肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞孵育后,T细胞的增殖能力明显降低,对肝癌细胞的杀伤能力也明显减弱。说明经肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞在体内外均可抑制T细胞的功能,使T细胞呈现耗竭状态。8.肝癌细胞外泌体中miR-146a-5p影响巨噬细胞的极化对肝癌细胞外泌体中的成分检测发现,外泌体中的miR-146a-5p异常高表达,当阻断巨噬细胞中的miR-146a-5p后,其向M2型极化的能力减弱。对肝癌细胞Hepal-6过表达或是沉默miR-146a-5p后,其外泌体中miR-146a-5p的含量也相应增加或是降低,并且使用其外泌体孵育巨噬细胞后,细胞的极化方向也相应的改变,即过表达miR-146a-5p的外泌体使巨噬细胞向M2型极化的能力增强,沉默miR-146a-5p的外泌体使巨噬细胞向M2型极化的能力减弱,类似的现象在人人的细胞系中也得到验证。说明肝癌外泌体中miR-146a-5p可使巨噬细胞向M2型极化。9.SALL4 调控 miR-146a-5p 的表达在小鼠原发性肝癌模型中,转录因子SALL4异常高表达,伴随肝脏中M2型巨噬细胞数目较多;并且,高表达SALL4的小鼠血清外泌体中miR-146a-5p含量较高,可使被孵育的巨噬细胞向M2型极化。当阻断肝癌细胞Hepal-6细胞中的SALL4后,细胞中miR-146a-5p下降明显,其外泌体诱导巨噬细胞向M2型极化的能力明显减弱。ChIP实验证实,SALL4可与miR-146a-5p的启动子区域结合。通过荧光素酶报告基因检测发现,SALL4可影响miR-146a-5p的转录活性。这些发现说明,转录因子SALL4可直接调控细胞中miR-146a-5p的转录活性进而调控细胞中miR-146a-5p的表达,以及外泌体中miR-146a-5p的含量,而外泌体则进一步影响巨噬细胞的极化,调控肿瘤进程。10.阻断SALL4能够减缓肿瘤进程我们在诱导小鼠肝癌的同时阻断肝细胞内SALL4表达,我们发现肝脏内T细胞的耗竭明显减弱,表现为细胞表面的抑制性受体表达降低,细胞分泌细胞因子的能力增强。同时,阻断肝细胞内SALL4后,肝细胞的恶性增殖能力减弱,肝脏的肿瘤直径缩小,H&E结果也显示肝脏的肿瘤恶性程度降低。说明阻断肝细胞内的SALL4后可减缓肿瘤的发展。结论:我们通过小鼠肝癌模型发现,在肝癌发生过程中肝脏T细胞耗竭,M2型肿瘤相关巨噬细胞增多。进一步研究发现,肝癌细胞来源的外泌体可活化巨噬细胞内NF-κB信号通路,产生大量的炎症因子,进一步促进肿瘤细胞的增殖及迁移;同时,肝癌细胞来源的外泌体可活化巨噬细胞内STAT3信号通路,抑制STAT1及C/EBPβ的水平,使细胞向M2型极化;并且,肝癌细胞外泌体“教育”后的巨噬细胞能够使T细胞表面抑制性受体(TIGIT、TIM-3、PD-1、CTLA4)上调,细胞因子(IL-2、TNF-α、FN-γ)分泌能力降低,T细胞表现为耗竭状态。进一步研究发现,这一现象主要是由外泌体中miR-146a-5p介导的。肝癌细胞中过表达miR-146a-5p可加剧外泌体对巨噬细胞M2型极化的影响,而阻断miR-146a-5p可使巨噬细胞向M2型极化减弱。研究证明,肝癌细胞中高表达的SALL4可直接调控miR-146a-5p的转录表达,进而促进外泌体对巨噬细胞的作用,重塑肿瘤微环境,加速肿瘤进程。