沙尘暴(sand dust,SD)是中国北方较为常见的一种灾害性天气现象,近年来沙尘暴的发生频率越来越高并且波及范围越来越广。常发生在春季的亚洲沙尘暴(ASD)起源于戈壁沙漠、塔克拉玛干沙漠等中国内陆黄土地区,颗粒物向下风向地区扩散,不仅波及中国东部、朝鲜半岛和同本,更远的可以飘过太平洋最终到达美国,遍及大半个北半球。ASD由于吸附性强,可携带多种化学物质,如来源于大气污染物(SO2,NO2)的硫酸盐(SO42-)和硝酸盐(NO3-),还包括一些微生物,如细菌、真菌、真菌孢子和病毒。近年来,随着这种生物气溶胶(生物颗粒)对所波及地区的生态系统和人类健康造成严重影响,吸附于ASD上的微生物群落引起了广泛关注。　　 亚洲沙尘暴浮尘颗粒物及这些微生物与呼吸系统的健康状况及迅速增长的发病率、死亡率有关。大量的流行病学调查显示,在沙尘暴发生期间,中国的肺炎入院率和韩国首尔的每日死亡率都有增加。有报道称,在台湾,沙尘暴发生与死亡率、心血管疾病的急诊处理以及肺炎入院率的增多保持一致。类似的现象在日本也有报道,日本雪杉树引起的花粉病、季节性变应性鼻炎的恶化以及成人和儿童哮喘的加剧都在沙尘暴发生期间出现。因此,流行病调查结果表明在沙尘暴发生期间,由微生物和ASD联合作用可引起肺炎或过敏性疾病的恶化,需要实验性的研究来证实流行病调查的结果。　　 我们以前的研究显示,在OVA刺激的小鼠气道上皮组织中发现,通过观察支气管肺泡灌沈液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)和组织学检查细胞图像,野生型ASD可增强过敏性气道炎症及杯状细胞的增殖,同时发现伴有嗜酸性粒细胞的抗原相关气道炎症加剧了,BALF中促炎症细胞因子如IL-5、MCP-3、IL-13、嗜酸细胞活化趋化因子和抗原特异抗体的产物(IgE,IgG1)的表达增强。然而,经过360℃加热除去毒性物质(如微生物、SO42-、NO3-等)的ASD(heated AsD,H-ASD)却只造成了轻微的影响,因此沙尘暴颗粒物表面附着物对炎症加剧起到了重要作用。　　 本研究中使用电子加热器将采集于日本福冈县北九州市的沙尘暴颗粒的样本进行加热处理,以除去吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本实验采用的微生物来自于石川县珠洲市上空的颗粒表面,共7种微生物,有:Nocardiopsis sp.(No.1-4),Bacillus sP.,Streptmyces sp.和Bjerkandera sp-。本研究应用OVA致敏小鼠,采用气管灌注的方法,分别将加热处理的ASD(H-ASD)、和加入各种微生物的H-ASD悬浮液注入小鼠气管内,观察小鼠肺组织病理形态学变化,支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞的分布变化,BALF中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达改变。从中筛选出一种恶化作用最为强烈的微生物,进行进一步验证实验。本研究是关于沙尘暴颗粒物附着的微生物对OVA诱导哮喘小鼠气道炎症作用的研究。　　 实验方法：　　 1、样本的采集　　 本研究使用的黄沙在2011年5月1日至3日在日本福冈北九州市折尾地区的产业医科大学上空采集,由LIDAR(Light Detection And Ranging)检测这批颗粒物的密度变化为350μg～550μg/m3(结果来自于日本长崎县公共健康与环境科学省)。应用图像分析软件(OLS3500/SFT-3500,Olympus and Shimadzu)分析显微图像得到颗粒的粒径大小,该方法最低检出限为1μm,粒径分布主要在2.8～5.9μm。　　 2、样本的处理　　 分别将采集到的ASD样本在电子加热器中经过360℃加热处理30min,以除去吸附于颗粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。　　 3、微生物的分离及获取　　 本研究使用的7种微生物是在2008年5月7日日本石川县珠洲市采集的黄沙颗粒上分离培养的。将采集到的黄沙分别用营养琼脂、血琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂以及沙保罗培养基培养,得到7种微生物。经过DNA分析,确定它们分别是Nocardiopsis sp.(No.1-4),Bacillus sp.,Streptomyces sp.和Bjercandera SP.。这些微生物用1%福尔马林1小时失活,而后以1500rpm离心10min,去掉上清液,余下减压干燥备用。　　 4、实验动物及染毒　　 从Charles River公司(神奈川,日本)购入5周龄雄性ICR小鼠,适应性喂养一周后,筛选出体重异常和/或病态的小鼠,开始实验。根据微生物种类的不同将实验动物分成9个组,每组1-5只不等,各实验组分别为:卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)组,OVA+H-ASD组,OVA+H-ASD+Nocardiopsis sp.(No.1-4),OVA+H-ASD+Bacillus sp.,OVA+H-ASD+Streptomyces sp.和OVA+H-ASD+Biercandera sp.,共29只。每周将小鼠在4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,经气管注入H-ASD(0.1ml/mouse)和OVA(0.1ml/mouse)以及7种失活微生物3.5μg,共投与四次。　　 在取得实验结果之后,选出作用最强的一种微生物,继续动物实验。每间隔一周,将小鼠4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,经气管注入颗粒物(0.1ml/mouse)和/或OVA(0.1ml/mouse)和/或微生物(2μg/mouse或8μg/mouse)。最后一次染毒的第二天,经小鼠腹腔注射20%/戊戈巴比妥,将其深度麻醉,用放血法处死。　　 5、实验动物的病理检测　　 取小鼠肺部固定于10%中性福尔马林缓冲液中,肺叶分离后,将其切割成2mm厚的碎块,用石蜡包埋,制成3μm厚的切片。HE染色后观察呼吸道由近端向远端嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。PAS染色后观察支气管上皮杯状细胞的增殖情况。应用显微镜对每个切片的呼吸道中炎症细胞和上皮细胞进行观察。　　 6、采集支气管肺泡灌洗液和血液　　 小鼠深度麻醉后心脏采血,1500rpm离心10min,取上清液,-80℃的深度冰箱中保存用于检测血清OVA特异性抗体IgGl和IgE的表达。取小鼠心脏血后,气管固定,用无菌生理盐水灌洗小鼠肺部两次,收集灌洗液后离心。取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于检测肺泡灌洗液中细胞因子和趋化因子的蛋白表达。　　 7、支气管肺泡灌洗液中的细胞计数　　 将肺泡灌洗液离心后得到的沉淀悬浮于生理盐水中,制成细胞悬液,显微镜下应用血细胞计数器直接计数细胞总数。细胞悬液应用细胞离心涂片机,离心后制成细胞涂片。应用Diff-Quik染色后,显微镜下观察计数中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。　　 8、支气管肺泡灌沈液中的细胞因子和趋化因子的检测　　 应用酶联免疫反应检测BALF中细胞因子和趋化因子的蛋白表达。其中细胞因子包括:白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、干扰素(interferon,INF)-γ和肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)、趋化因子包括:嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumably secreted,RANTES)、巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)-1α、角化细胞趋化因(Keratinocyte chemoattractant,KC)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotacticprotein,MCP)-1和MCP-3。　　 9、OVA特异性IgE和IgG1抗体的检测　　 用鼠OVA-IgEELISA试剂盒和鼠OVA-IgG1ELISA试剂盒检测血清中的OVA特异性IgE和IgG1抗体。　　 10、统计学分析　　 本研究应用SPSS13.0统计学软件进行分析,统计结果表述为平均数±标准差,采用单因素方差分析比较不同染毒组的实验数据;当组间差异具有统计学意义时,采用SNK法进行组间比较,p＜0.05具有统计学意义。　　 实验结果：　　 1、ASD表面成分的检测结果　　 ASD颗粒物的大小主要分布为2.8～5.9μm。ASD颗粒物的各种元素分布为28%Si、7%Al、3.8%Fe、3.2%Ca、1.8%Mg、0.36%Ti、0.10%P、0.091%Mn、0.051%Ba和0.025%Sr。　　 2、7种微生物对小鼠肺部病理学改变的影响　　 OVA+H-ASD+Streptmyces sp.与OVA+H-ASD+Bjerkanderasp.组发现,与OVA+H-ASD组相比,小鼠肺呼吸道上皮中的杯状细胞显著增殖,特别是Bjerkandera sp.组增生最显著,小鼠气管粘膜下嗜酸性粒细胞显著增多。　　 3、7种微生物对小鼠支气管肺泡灌沈液中炎症细胞分布的影响　　 OVA+H-ASD+Bierkandera sp.组小鼠BALF中巨噬细胞数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞与OVA组比较显著增多。　　 4、7种微生物对小鼠支气管肺泡灌沈液中细胞因子和趋化性细胞因子表达的影响　　 Bjerkandera联合作用组的KC、MCP-1、RANTES、MCP-3、IL-12水平升高。　　 5、Bjerkandera sp.对小鼠肺部病理学改变的影响　　 OVA+H-ASD+B.Sp联合作用能引起小鼠肺呼吸道上皮的杯状细胞重度增殖,且气管粘膜下嗜酸性粒细胞和淋巴细胞显著增多,基底膜增厚,呈现玻璃样变。　　 6、Bjerkandera sp.对小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞分布的影响　　 与OVA+H-ASD相比,OVA+H-ASD+B.sp组小鼠BALF中巨噬细胞的含量增多。与H-ASD+B.sp2和H-ASD+B.sp8组分别比较,OVA+H-ASD+B.sp2/B.sp8联合处理进一步导致小鼠BALF中的嗜酸性粒细胞数增多。　　 7、Bjerkandera sp.对小鼠支气管肺泡灌沈液中细胞因子和趋化性细胞因子表达的影响　　 OVA+H-ASD+B.sp8联合作用组中BALF的IL-1β、IL-6、IL-13和TGF-β1明显高于对照组和OVA单独作用组,另外,IL-1β、IL-5、IL-13和TGF-β1表达也强于H-ASD单独作用组。H-ASD+B.sps组的小鼠BALF中Eotaxin、RANTES、KC和MCP-1的水平与对照组及B.sp8单独处理组相比显著升高。　　 8、Bjerkandera sp.对小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG1表达的影响　　 OVA+H-ASD+B.sp8组小鼠血清中OVA特异性IgG1表达比B.sps和H-ASD+B.sp8组的表达增强。在所有组别中未见OVA特异性IgE的表达。　　 结论：　　 1、7种微生物,特别是Bjerkandera sp.,能加剧OVA诱导的哮喘小鼠的气道炎症反应。　　 2、Bjerkandera sp.通过Th2反应相关的细胞因子和趋化性细胞因子的表达而激活Th2免疫反应,进而加重OVA诱导哮喘小鼠的气道炎症反应。