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目的乏氧条件下,肿瘤细胞中的大部分葡萄糖转化为乳酸并被分泌出细胞,导致肿瘤细胞需要替代碳源来支持能量产生和物质积累。谷氨酰胺作为人体血液中最为丰富的氨基酸,已被证明可以在乏氧条件下通过还原性羧化的作用生成脂肪酸来提供碳源。代谢物中的不同元素通常具有不同的代谢命运,一个谷氨酰胺含有五个碳原子和两个氮原子以氨基和酰胺基团的形式存在。乏氧条件下,当肿瘤细胞利用掉谷氨酰胺的碳,它们如何应对可能溢出的氮?本研究的目的是探究肿瘤细胞谷氨酰胺碳氮代谢的分子机制。方法1.补充碳源,氨基酸和核苷酸等代谢物,研究它们是否对谷氨酰胺有替代作用,利用代谢流技术,研究其它代谢物能否转化为谷氨酰胺。2.利用代谢质谱、代谢流(13C5-谷氨酰胺)分析技术和全自动生化分析仪检测常氧和乏氧条件下肿瘤细胞中谷氨酰胺碳的去向以及谷氨酰胺相关含氮化合物的生成情况。3.利用代谢组学技术筛选常氧和乏氧条件下肿瘤细胞中含氮代谢物的差异并进一步确认。4.常氧和乏氧条件下,利用代谢流(13C5-谷氨酰胺)技术检测谷氨酰胺来源的天冬氨酸的代谢去向。5.常氧和乏氧条件下,利用代谢流(氨基-15N-谷氨酰胺,酰胺15N-谷氨酰胺)技术检测谷氨酰胺来源的氨基酸和核苷酸生成情况。不同条件下培养MCF7,HeLa,A549,HCC-LM3,SCG7901,4T1细胞,检测培养液中代谢物变化。补充碳源,检测乏氧条件下肿瘤细胞中代谢物变化。6.利用Western blot技术检测MCF7和HeLa细胞乏氧不同时间点谷氨酰胺代谢的蛋白变化情况。检测常氧、乏氧和Antimycin A条件下NADH/NAD+变化情况。检测Antimycin A和乏氧条件下谷氨酰胺代谢的情况。补充丙酮酸类似物α-丁酮酸（AKB）检测不同条件下谷氨酰胺代谢情况。7.代谢质谱技术检测正常人、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌患者血清中代谢物的情况。HeLa细胞接种裸鼠,检测荷瘤小鼠和正常小鼠血清和肿瘤组织中代谢物的变化。分别敲低代谢途径上的酶,构建稳转细胞系,检测常氧和乏氧条件下细胞增殖情况;将细胞系接种裸鼠,体内验证敲低相关蛋白对肿瘤增殖的影响。结果1.肿瘤细胞的增殖需要谷氨酰胺的氮。2.乏氧条件下MCF7和HeLa细胞对谷氨酰胺的利用增加,谷氨酰胺来源的乙酰辅酶A明显增加,但谷氨酰胺生成的常见含氮化合物氨、尿素和丙氨酸却降低。3.代谢组学检测到226种含氮化合物,发现乏氧条件下升高的六种化合物中五种是核苷酸代谢过程中的,包括包括二氢乳清酸,乳清酸,IMP,鸟苷和肌苷。4.乏氧条件下谷氨酰胺来源的天冬氨酸生成二氢乳清酸和乳清酸。5.乏氧条件下,谷氨酰胺的氨基氮和酰胺氮生成的二氢乳清酸和乳清酸明显升高。乏氧条件下,肿瘤细胞MCF7,HeLa,A549,HCC-LM3,SCG7901,4T1培养液中的二氢乳清酸明显升高。补充α酮戊二酸二乙酯（DMαKG）后,细胞内和分泌出去的二氢乳清酸明显降低。6.乏氧和AntimycinA导致的电子堆积促进肿瘤细胞二氢乳清酸的生物合成和分泌。补充AKB后二氢乳清酸的产生和分泌均明显降低。7.肿瘤患者血清中乳清酸明显升高,小鼠体内证明肿瘤组织中二氢乳清酸升高被分泌到血清中继而转化为乳清酸。肿瘤细胞的增殖需要谷氨酰胺生成的二氢乳清酸这一代谢通路。结论核苷酸的合成需要谷氨酰胺的氮,但乏氧条件下,谷氨酰胺的氮富集在二氢乳清酸和乳清酸中并没有继续生成下游的UMP。二氢乳清酸,而不是乳清酸,继而被分泌出细胞。我们在体内证明了这一特殊代谢途径的存在,且其为肿瘤细胞增殖所需。这一代谢途径使谷氨酰胺主要转化为乙酰辅酶A用于脂肪生成,其余的碳和氮被安全地去除。我们的结果揭示了谷氨酰胺碳和氮在乏氧条件下如何协同代谢,使我们更全面的认识了谷氨酰胺代谢。