第一章DBM/PLA多孔复合生物活性材料的制备及相关性能研究　　 目的:为制备具有局部抗感染能力的GS/DBM/PLA多孔复合生物活性材料,采用不引入高温及有机溶剂残留的绿色超临界二氧化碳(SC-COz)合成法首先制备DBM/PLA多孔复合生物活性材料,确定与DBM复合的PLA分子量及DBM/PLA复合的最佳比例。　　 方法:　　 (1)选取健康供体皮质骨、粉碎、过筛、选择粒径为200μm～300μm的骨粉,按山西省医用组织库同种骨生产标准进行冷冻、清洗、脱钙处理,制备DBM。　　 (2)PLA最佳分子量的选择:取不同分子量的PLA(以2倍质量的NaCL作为造孔剂),放入超临界SC-CO2反应釜内,调节温度和压力,在温度37±1℃,压力200±1Bar条件下,反应30min,打开反应釜,取出样品,蒸馏水浸沥48h去除造孔剂,冷冻干燥,三层无菌包装,20kGy60Co辐照灭菌后备用。采用比重法检测材料的孔隙率,微机控制万能试验机测定材料的抗压强度和弹性模量进行生物力学性能评价。　　 (3)DBM/PLA复合比例确定:将DBM与10万分子量PLA按质量比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3进行混合,相同方法加入造孔剂(与复合材料的质量比为2:1),充分混匀后放入超临界SC-CO2反应釜内,以相同的条件制备复合材料,蒸馏水浸沥48h,冷冻干燥,三层无菌包装,20kGy60CO辐照灭菌后备用。通过比重法评价材料的孔隙率,微机控制万能试验机测定材料的抗压强度和弹性模量进行生物力学性能评价,复苏传代L-929小鼠成纤维细胞株,MTT法检测材料的细胞毒性,冷冻干燥后,离子溅射仪喷金,电子扫描显微镜(SEM)观察孔隙情况。　　 (4)采用SPSS18.0统计软件包进行统计分析,数据用(X)±S表示,孔隙率采用等级相关,各组间采用多样本均数的单因素方差分析,若方差齐性,组间多重比较采用最小极差法(LSD),方差不齐,多重比较采用Tamhanes T2法。两材料组间采用独立样本均数的t检验或t’检验(方差不齐时)。细胞毒性试验所测OD值采用析因设计方差分析,检验水准均为α=0.05。　　 结果:　　 (1)PLA分子量确定:①使用SC-CO2合成法制备的PLA多孔支架材料的孔隙率均大于60％,且随着PLA分子量的增加而增大(r=0.909,P<0.001),50万分子量的PLA孔隙率达到了85.52％,结构相当疏松。②10、50万分子量的PLA支架材料在经过抗压实验后,由于材料具有很强的韧性,整体被压扁,材料结构更加致密,而5万分子量的PLA支架材料经过抗压实验,材料被压碎,说明5万分子量PLA脆性较大,聚合后受外力作用易破碎。③生物力学检测,10万分子量PLA支架材料抗压强度及弹性模量最高,分别为(264.03±41.11)MPa和(49.71±6.69)MPa,5万分子量PLA支架材料抗压强度及弹性模量次之,50万分子量PLA支架材料抗压强度及弹性模量很低,其弹性模量只有(2.95±0.48)MPa,各组间均存在统计学差异。　　 (2)DBM/PLA复合比例确定:①DBM/PLA复合材料大体观察结构疏松,有较好的孔隙率,类似人体松质骨样结构。不同比例DBM/PLA复合材料孔隙率均大于60％,且随着DBM含量的增加而增大(r=0.945,P<0.001),DBM/PLA复合材料的抗压强度及弹性模量却随着DBM含量的增加而逐渐降低,当DBM含量大于60％时,力学性能下降显著:抗压缩强度(38.44±3.29)MPa和弹性模量(3.49±0.55)MPa,与其余各组材料之间均存在显著性差异。②各材料组不同时间点细胞OD值间有显著差异(F=1256.695,P<0.001),各组间存在显著差异(F=3584.657,P<0.001),材料与时间因素之间存在交互效应(F=224.571,P=0.000)。当DBM含量在50％以下时,DBM/PLA复合材料明显的抑制了小鼠L929成纤维细胞的增殖,细胞评级为2-3级,有的甚至达到了4级,但随着DBM比例的增大,细胞毒性逐减低,达到50％后,基本与正常培养基组相同,对细胞增殖无明显影响,细胞毒性评级为0级或1级,符合植入类材料的要求。　　 (3)扫描电子显微镜观察所制备的含60％DBM复合材料,DBM与PLA混合均匀,结合致密,材料孔隙分布均匀,孔隙大小大约在200μm-400μm之间,孔洞连通性好,且在孔隙内壁上,仍可见大量孔径为20μm-30μm左右的小孔隙。　　 结论:　　 (1)采用SC-CO2合成法制备的10万分子量的PLA多孔支架材料,具有较好的孔隙率及最佳的抗压强度及弹性模量,更适合与DBM进行复合。　　 (2)采用SC-CO2合成法制备的DBM/PLA多孔复合支架材料,孔隙率随着DBM含量的增加而增大,力学性能随着DBM含量的增加而减弱,细胞毒性随着DBM含量的增加而逐渐降低,综合孔隙率、生物力学性能及细胞毒性实验,我们认为6:4为SC-CO2法制备DBM/PLA的最佳复合比例。　　 第二章 GS/DBM/PLA多孔复合生物活性材料的制备及缓释性能研究　　 目的:采用SC-CO2合成法制备硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate GS)、DBM、PLA三者多孔复合生物活性材料(GS/DBM/PLA),评价GS/DBM/PLA复合材料的理化及缓释性能。　　 方法:　　 (1)根据金黄色葡萄球菌可以形成细菌菌落的原理,利用平板法进行细菌计数,制备金黄色葡萄球菌标准溶液,保证后续实验中金黄色葡萄球菌数量恒定。　　 (2)取辐照与未辐照庆大霉素粉末各1g,制备庆大霉素标准品容液,微生物检测法,测定辐照与未辐照庆大霉素抑菌圈直径,比较辐照前后庆大霉素效价；利用所测得的辐照后不同浓度庆大霉素稀释液抑菌圈直径,绘制庆大霉素浓度与抑菌圈直径的半对数标准曲线,给出直线回归方程。　　 (3)按DBM/PLA(6/4)的比例分别取0.6gDBM(粒径大小为200μm～300μm)、0.4gPLA(10万分子量),0.5g庆大霉素粉末,2gNaCL颗粒造孔剂,以SC-CO2合成法,与前述实验相同的反应条件制备GS/DBM/PLA复合材料。　　 (4)GS/DBM/PLA理化性能能测定:采用比重法检测材料的孔隙率、微机控制万能试验机测定材料的抗压强度和弹性模量进行生物力学性能评价,复苏传代L-929小鼠成纤维细胞株,MTT法检测细胞毒性。　　 (5)GS/DBM/PLA缓释性能能测定:①将制备好的GS/DBM/PLA复合材料修剪成统一规格,准备15支试管,无菌条件下各加入10ml生理盐水,将制备好的材料放入试管1中,37℃浸泡24小时后取出,放入2号试管,依次至15d,使GS/DBM/PLA复合材料中的庆大霉素逐渐释放于盐水中,对1-15试管中的盐水做抑菌试验,测定其不同时间抑菌浓度并绘制体外释放曲线。②将制备好的GS/DBM/PLA复合材料修剪成统一规格,行大鼠肌袋内埋入实验,于术后第1d、4d、7d、9d、12d、15d后取出植入材料颗粒周围3mm肌肉组织,同时腹主动脉取血2ml(肝素抗凝),-20℃低温冰箱保存。在无菌条件下,取出保存的肌肉组织、血液,分别缓冲液匀浆,离心,取上清,微生物检测法测定不同时间抑菌浓度并绘制体内释放曲线.　　 (6)采用SPSS18.0统计软件包进行统计分析,数据用(X)±S表示,两材料组问采用独立样本均数的t检验,配对资料采用配对(t)检验,采用直线回归建立回归方程,细胞相容性所测的OD值采用析因设计资料的方差分析法,检验水准为α=0.05。　　 结果:　　 (1)对辐照前后庆大霉素抑菌圈直径做配对t检验:t=0.020,P=0.984,无统计学差异,说明辐照对庆大霉素效价的影响很小；对辐照后庆大霉素浓度与抑菌圈直径做直线回归,庆大霉素浓度与抑菌圈直径的直线回归方程为:Y=7.576+5.113X,r=0.990,P<0.001,通过此方程可将抑菌圈直径换算为GS浓度。　　 (2)GS/DBM/PLA理化性能测定:　　 ①GS/DBM/PLA孔隙率:GS/DBM/PLA及单纯DBM/PLA(6/4)材料的孔隙率做t检验,P>0.05,无统计学意义,GS/DBM/PLA复合材料孔隙率为77.076％,略低于单纯DBM/PLA(6/4)复合材料的79.71％。　　 ②GS/DBM/PLA生物力学性能:GS/DBM/PLA及单纯DBM/PLA(6/4)材料的抗压强度及弹性模量做t检验,P值均大于0.05,说明差异无显著性,无统计学意义,GS/DBM/PLA复合材料的抗压强度及弹性模量较单纯DBM/PLA(6/4)复合材料略有所下降,但影响不大。　　 ③GS/DBM/PLA细胞毒性:各材料组不同时间点细胞OD值间有显著差异(F=1376.194,P<0.001),各组间存在显著差异(F=2.983,P<0.001),材料与时间因素之间存在交互效应(F=1376.194,P<0.000),从第3-7天,对照组、DBM/PLA组及GS/DBM/PLA组之间无统计学差异(P值均大于0.05),GS/DBM/PLA复合材料浸提液培养细胞1～7天内细胞增殖率均大于90％,细胞毒性评级为0级或1级,表明GS/DBM/PLA基本无细胞毒性与单纯DBM/PLA(6:4)材料组类似。　　 (3)GS/DBM/PLA缓释性能能测定:　　 ①GS/DBM/PLA体外缓释性能:1-3dGS大量释放,从第4d开始GS进入缓慢释放过程,从第8天开始GS浓度基本稳定在15-30μg/ml,第15天,GS浓度为16.96μg/ml,仍高于金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(2μg/ml),可起到抑菌效果。　　 ②GS/DBM/PLA体内缓释性能:随着时间的延长,GS浓度逐渐降低,第15天,局部肌肉中GS浓度仍能达到3.00μg/ml,仍高于金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(2μg/ml),可起到抑菌效果,肉眼观察血液中GS浓度抑菌圈,发现基本没有出现抑菌圈,说明血液中GS浓度含量低于2μg/ml,无法起到抑菌效果,基本无全身毒副作用。　　 结论:　　 (1)辐照对庆大霉素效价的影响很小,辐照前后庆大霉素的效价变化不大,利于与/DBM/PLA进行复合,后进行辐照灭菌处理。　　 (2)采用SC-CO2合成法制备的GS/DBM/PLA多孔复合支架材料,具有较好的孔隙率,一定的生物力学强度,无细胞毒性,15天之内,不论体内还是外从复合材料中缓释出的GS均可以达到有效抑菌浓度,且全身毒副作用小。　　 第三章GS/DBM/PLA多孔复合生物活性材料治疗大鼠感染性股骨髁缺损实验研究　　 目的:建立大鼠股骨髁缺损感染模型,植入DBM/PLA及GS/DBM/PLA多孔复合材料,评价DBM/PLA及GS/DBM/PLA多孔复合材料修复骨缺损及GS/DBM/PLA材料的抗感染能力,为今后可能的临床应用提供实验依据。　　 方法:　　 (1)大鼠股感染性股骨髁缺损模型建立及材料移植:　　 ①取健康成年Wistar大鼠84只,4只作为空白对照组(A组)不做任何处理,其余各40只作为GS/DBM/PLA材料组(B组)及DBM/PLA材料组(C组)。麻醉,平卧固定于操作台,用直径1.6mm的牙科球钻制取大鼠双侧股骨髁缺损,无菌生理盐水冲洗缺损,取出事先准备好的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus SA)标准溶液(1x1011CFU/ml),微量加样器吸取10μl,注入股骨髁缺损,静置30min后,将B(GS/DBM/PLA组)、C(DBM/PLA组)两组材料分别等量(约80mg)植入缺损处,术肢不固定,常规饲养。　　 ②术后注意观察动物的一般情况,于术后1d、4d、7d、9d、12d、15d,B、C两组各取4只实验动物,麻醉后,腹主动脉采血,进行白细胞计数。　　 ③术后2w、4w、6w、8w,B、C两组各取4只实验动物,脱颈处死动物,无菌条件下截取双侧股骨髁缺损区域取2g左右骨块,研磨、称取1g研磨后骨块,加入10ml生理盐水,利用平板法进行细菌学计数。　　 (2)大鼠股感染性股骨髁缺损修复实验:　　 ①取健康成年Wistar大鼠36只,随机分成3组,植入的材料分别为:A组:GS/DBM/PLA材料组,(缺损处加入SA)；B组:DBM/PLA材料组(缺损处加入SA)；C组:单纯DBM/PLA材料组(对照组,缺损处不加入SA,不感染实验动物)。　　 ②术后4w、6w、8w,每组3只/6侧,麻醉后摄X光片作放射线检查,了解新骨生长和缺损修复情况,用Image-Pro Plus5.0图像分析软件测取缺损修复区单位面积灰度值,以代替骨密度评价缺损区骨修复情况。　　 ③术后6w、8w时,每组4只,另取4只正常同年龄同体重动物作为对照组(D组),截取左侧股骨髁,将股骨髁平放固定于生物力学机工作台上,压紧后,启动压力装置以5mm/min的加载速度施压,观察股骨髁位移/时间和位移/载荷变化,当位移达2mm(股骨髁厚度约5mm)视为结构破坏,记录破断载荷(受压面积约24mm2),评价承载能力。　　 ④术后4w、6w、8w时,每组4只,截取右侧股骨髁,经固定、脱钙、脱水、包埋后,用硬组织切片机制取厚度为5μm切片,进行HE染色,光学显微镜下观察植骨区骨愈合情况。　　 (3)采用SPSS18.0统计软件包进行统计分析,数据用(X)±S表示,各组间采用多样本均数的单向方差分析,若方差齐性,组间多重比较采用最小极差法(LSD),方差不齐,多重比较采用Tamhanes T2法,白细胞计数值采用析因设计方差分析,检验水准为α=0.05。　　 结果:　　 (1)大鼠股感染性股骨髁缺损模型建立及材料移植:　　 ①大体观察:术后动物手术部位均出现一定程度的肿胀,于术后2w无菌条件下取材,发现C组动物股骨髁缺损处出现了大量的脓性分泌物,取分泌物接种培养,革兰氏染色证明为金黄色葡萄球菌。　　 ②白细胞计数,GS/DBM/PLA组与DBM/PLA组之间有统计学差异(F=222.141,P<0.001),两组材料不同时间点白细胞计数值间有显著差异(F=21.414,P<0.001),材料与时间因素之间存在交互效应(F=224.571,P<0.001),术后15d内,GS/DBM/PLA组白细胞数明显低于DBM/PLA组,DBM/PLA组15d内,白细胞数均明显高于正常值(4.545±1.358)×109/L,GS/DBM/PLA组白细胞数只是前3d有所升高,从第4d起开始就趋于正常。　　 ③骨组织细菌密度:对2w、4w、6w、8w分别进行方差分析,结果类似,差异均有显著性:2w时F=52.718、P<0.001,4w时F=94.462、P<0.001,6w时F=138.535、P<0.001,8w时F=42.026、P<0.001；GS/DBM/PLA组细菌数量明显低于DBM/PLA组,两组细菌数量至少相差3个以上数量级,表明GS/DBM/PLA组材料能有效抑制细菌的生长繁殖。　　 (2)大鼠股感染性股骨髁缺损修复实验:　　 ①X线观察结果:A组(GS/DBM/PLA含SA组)动物植入4w时,缺损修复区有较为明显且均匀絮状阻射影,缺损中心密度较高；植入6w时,絮状阻射影更为致密,缺损中心已基本无透光区；植入8w时,阻射影趋于致密,缺损区密度接近于正常骨质与C组表现相似。B组(DBM/PLA含SA组)植入8w时,絮状阻射影进一步致密,缺损中心透光区变小,不规则。　　 ②骨密度计量分析:4w、6w、8w分别取材,对灰度值(骨密度)进行方差分析,差异均有显著性:4w时F=56.248、P<0.001,6w时F=57.704、P<0.001,8w时F=25.793、P<0.001:进一步作组间两两比较,各组间也均存在统计学差别(P<0.001),C组(DBM/PLA组,无SA)灰度值最大,B组(DBM/PLA组,含SA)灰度值最小,且A组(GS/DBM/PLA组,含SA)明显高于B组(DBM/PLA组,含SA),差异有统计学意义,从一个角度说明了DBM/PLA材料明显促进了骨缺损修复,GS/DBM/PLA通过局部抗感染能力,有利于骨缺损的修复。　　 ③移植物抗压生物力学测试:6w、8w取材,对破断载荷和破断强度做方差分析,差异有显著性,6w时F=50.381、P<0.001,8w时F=93.291、P<0.001；进一步作组间两两比较,除6w,A,C两组无统计学意义外(P=0.097),其余各组间均存在统计学差别(P<0.05),D组(正常组)破断载荷和破断强度最高,C组(DBM/PLA组,无SA)次之,B组(DBM/PLA组,含SA)破断载荷和破断强度最低,且A组(GS/DBM/PLA组,含SA)明显高于B组(DBM/PLA组,含SA),差异有统计学意义,说明DBM/PLA材料明显促进了骨缺损修复,GS/DBM/PLA通过局部抗感染能力,有利于骨缺损的修复。　　 ④组织学观察:A组(GS/DBM/PLA组,含SA)植入4w,植入材料可见少量炎性组织长入,植入6w,间充质细胞向植入骨内长入,内可见少量炎症细胞及多核细胞,植入材料周围可见成骨细胞；植入8w,新生骨组织长满植入区,达到骨愈合与C组(DBM/PLA组,无SA)八周时情况类似。B组(DBM/PLA组,含SA)植入4w,植入材料周围被炎性纤维组织包裹,内有大量的炎症细胞；植入8w,植入材料几乎被炎症组织吸收,但仍可见DBM的碎片,植入区被纤维炎症组织所填充。　　 结论:DBM/PLA多孔复合材料具有较好的骨缺损修复能,GS/DBM/PLA多孔复合材料具有较好的抗感染及骨缺损修复能力。