刺参(Apostichopus japonicus)具有极高的经济价值,是中国北方重要的经济类水产养殖动物之一。刺参细菌性疾病是困扰刺参养殖业的主要问题,病原弧菌是其主要的致病菌。为消除病原菌威胁,大量的抗生素和化学类药物被投入使用,最终导致水环境污染,菌群微生态失衡,抗生素残留,细菌耐药性产生,制约了刺参养殖业的可持续发展,因此亟需一种新型的抑菌方式以替代抗生素。到目前为止,国际研究领域的主流替代方式是采用噬菌体疗法,关于噬菌体应用的研究已经成为热点,涉及诸多领域,如农业、畜牧业、食品安全保障行业等。鉴于此,本课题将噬菌体的应用策略引入到苗期刺参养殖领域,探索噬菌体疗法在该领域应用的有效性与安全性。本课题的主要研究内容和结果总结如下:(1)筛选获得引发苗期刺参感染的病原弧菌两株,分离得到相应病原菌的噬菌体,并对其进行了必要的理化性质分析。经透射电镜观察、生理生化实验和分子生物学实验鉴定两株病原弧菌为嗜环弧菌和灿烂弧菌,分别命名为嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL。采用人工攻毒处理方式,测定了两株优势病原弧菌的半数致死量,嗜环弧菌VC1的半数致死量LD50值为8.75 × 105 CFU/g,半数致死浓度LD50值为3.45 × 106 CFU/mL,灿烂弧菌VS-ABTNL的半数致死量LD50值为3.40 × 104 CFU/g,半数致死浓度LD50值为1.68 × 105 CFU/mL,两株优势分离菌株对苗期刺参均具有高致病性。丝裂霉素C诱导实验结果表明该两株优势病原弧菌均为非溶源性菌株。从环境水样中分离得到嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL的噬菌体各两株,分别命名为vibrio phage Vc1、vibrio phage Vc2和PVS2、PVS3。对分离纯化获得的四株噬菌体进行了形态学、一步生长曲线、宿主谱、体外抑菌和其它生理生化特性分析,结果表明,四株噬菌体宿主专一性强,裂解性高,在潜伏期、裂解量、体外抑菌效果方面,vibrio phage Vc1和PVS3分别强于vibrio phage Vc2和PVS2。将噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3提交到中国微生物菌种保藏中心,保藏号分别为CGMCC No.9101和CGMCC No.12263。(2)对噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组进行了高通量测序分析与注释,进一步确定了两株噬菌体的基因特性、分类学地位以及基因层面的应用安全性。采用氯化铯密度梯度离心浓缩噬菌体,提取两株噬菌体的基因组DNA,使用Illumina测序技术对两株噬菌体的全基因组DNA进行生物信息学分析,分析结果表明噬菌体vibrio phage Vc1和噬菌体PVS3均为双链线性DNA,vibrio phage Vc1基因组全长44,541 bp,GC含量为44.61%,预测出19个具有实际功能的基因,包含一个胞壁水解酶基因,而噬菌体PVS3基因组全长为43,573 bp,GC含量为43.95%,预测出具有23个实际功能的基因。以上两株噬菌体基因组均未发现tRNA编码基因,但均具有保守的RNA聚合酶基因。根据RNA聚合酶亲缘关系比对分析,进一步确定了噬菌体virbio phage Vc1和PVS3的分类学地位,噬菌体virbio phage Vc1属于长尾噬菌体科,T5-like噬菌体属;噬菌体PVS3属于长尾噬菌体科,T1-like(Tunalikevirus)噬菌体属。全基因组序列比对分析结果表明以上两株噬菌体在Genbank数据库中无同源性,均为新发现的噬菌体。同时,噬菌体virbio phage Vc1和PVS3的基因组中均未发现毒力基因、溶源基因及毒力转座子等致病因子,均属于裂解性噬菌体,因此具有基因水平的应用安全性。以上两株噬菌体的全基因组序列已经提交到NCBI,序列识别号分别为KJ502657以及MF497422。(3)设计三种噬菌体施用剂型——注射剂、冻干粉饲料添加剂和混合噬菌体液体浸浴剂,分别证明了三种噬菌体剂型在防控苗期刺参弧菌感染中的有效性。在人工攻毒条件下,注射噬菌体vibrio phage Vc1可以将刺参存活率由30%提高到60%,注射噬菌体PVS3可以将刺参存活率由20%提高到65%。噬菌体冻干粉制剂制备过程中,确定脱脂牛奶为最佳保护剂。饲喂实验中,噬菌体冻干粉按5%添加量添加基础饲料,实验结果表明,饲喂嗜环弧菌噬菌体可有效地提高刺参存活率,各处理组均达到60%以上,饲喂灿烂弧菌噬菌体也可有效地提高刺参存活率,各处理组均达到50%以上,并且两种混合噬菌体的饲喂处理组,刺参存活率均能达到抗生素处理组水平(80%)。混合噬菌体浸浴实验中,噬菌体浸浴组刺参存活率(85%)超过实验中抗生素处理组水平(65%)。同时,在噬菌体饲喂保护和浸浴治疗实验中,养殖水体和刺参肠道内均检测到噬菌体的存在,且肠道内噬菌体效价水平低于水体噬菌体效价水平。噬菌体4℃C长期保藏时,以脱脂牛奶为保护剂的噬菌体真空冷冻干燥处理对噬菌体效价的维持效果最佳,在监测的14个月时间内均保持较高效价水平(≥107PFU/mL)。(4)考察了施用噬菌体对苗期刺参主要生理指标的影响,涉及刺参体腔细胞层面、刺参体腔非特异免疫酶活层面、刺参生长指标及刺参肠道菌群结构层面。将高纯度噬菌体颗粒(≥1010PFU/mL)与刺参体腔细胞进行体外共培养,结果表明,噬菌体不会对刺参体腔细胞的形态、活性尤其是吞噬细胞活性产生影响。酶活层面主要考察注射噬菌体和饲喂噬菌体冻干粉对刺参体腔非特异免疫酶活的影响,注射实验又包含攻毒和非攻毒两种方式。在未攻毒情况下,注射噬菌体能显著提高刺参体腔液中一氧化氮合酶和酸性磷酸酶活性(P<0.05),对溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性无显著影响;在攻毒情况下,注射噬菌体会降低刺参溶菌酶和超氧化物歧化酶的应激反应水平,推测注射的噬菌体与刺参机体免疫系统有协同消杀病原菌作用,且在攻毒后的48 h,噬菌体处理组溶菌酶和超氧化物歧化酶水平与空白对照组无显著差异(P>0.05),一氧化氮合酶和酸性磷酸酶水平仍显著高于空白对照组(P<0.05),在60天的饲喂实验期间,饲喂含有噬菌体冻干粉的饲料同样能显著提高刺参体腔液中一氧化氮合酶和酸性磷酸酶活性(P<0.05),以上结果表明噬菌体能被刺参的非特异免疫系统识别,引起刺参的部分免疫反应。此外,饲喂噬菌体不会对刺参的主要生长指标(增重、摄食率、饲料转化效率及脏壁比)产生影响,在降低实验中弧菌属微生物丰度的同时,不会影响刺参正常肠道菌群微生物的丰度水平,说明施用噬菌体有效地抑制了目标菌株的生长。综上,本研究从替代抗生素的角度出发,以两株病原弧菌——嗜环弧菌和灿烂弧菌为目标菌株,设计实验揭示了施用噬菌体在防控苗期刺参弧菌感染的有效性,能达到甚至超过抗生素的施用效果,在噬菌体的基因层面及刺参的主要生理指标方面证明了施用噬菌体的安全性。本研究最终确定了噬菌体疗法在苗期刺参养殖领域的可行性,为苗期刺参的绿色、安全、无抗化养殖开辟了一个新的思路。