肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在各种刺激因子的作用下大量活化、增殖是肝纤维化发生、发展的重要环节。HSCs的活化指HSCs从静态细胞表型转化为具有增殖性的肌成纤维细胞,并分泌大量细胞外基质,尤其是胶原纤维。其形态学变化表现为胞体增大与维生素A脂滴减少等特征性改变。因此我们推测,肝纤维化过程中必然伴随着HSCs数量或体积的增加,以及由此而导致的肝组织内胶原纤维体积的增加。迄今为止,肝纤维化发生发展过程中肝组织内HSCs数量或体积变化对胶原纤维体积的影响尚无可靠的体视学定量研究证据。本研究建立了CCl₄诱导的肝纤维化模型,采用体视学方法结合光镜与电镜技术研究肝纤维化大鼠肝组织内胶原纤维、肝血窦和窦周隙等结构的总体积以及HSCs的数量和总体积变化,以期提供肝纤维化大鼠肝组织内的主要结构的体积改变数据,并为HSCs活化（数量和体积增加）在肝纤维化发展中的作用提供可靠的形态定量证据。另有文献报道,异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate,MgIG）能通过抑制HSCs的活化或凋亡改善肝组织纤维化,但目前亦无可靠的体视学定量研究证据。因此本研究同时研究了MgIG对肝纤维化大鼠肝组织内相关重要结构影响的形态学定量数据,以期为MgIG有无阻止肝纤维化发生的作用及与HSCs活化的关系提供依据。第一部分肝纤维化组织结构改变对免疫组化石蜡切片皱缩系数的影响目的:器官组织经过包埋、切片、染色等组织处理后均会产生皱缩,从而影响利用器官组织切片得到的密度值等体视学定量参数。因此本研究首先采用设计依赖体视学方法并结合卡瓦列里原理比较研究正常与肝纤维化大鼠肝组织经过组织处理（石蜡包埋、切片及免疫组化染色）后的皱缩系数,以对本研究后面的重要参数之一—肝星状细胞的数密度值进行矫正,避免组织皱缩对结果的影响;并同时探讨肝纤维化所致肝组织结构的改变对皱缩系数的影响。方法:将11只健康3月龄雄性SD大鼠随机分为对照组（n=5）、模型组（n=6）。在造模5周后取下大鼠肝脏,经4%多聚甲醛固定48h,放入70%乙醇中保存。从对照组和模型组中每只大鼠肝脏随机抽选1个约2 mm厚肝组织块,称重、测密度,该肝组织块固定后体积（V）为该肝组织块重量除以密度。将每个组织块行石蜡包埋后切成14μm厚（H’）的连续切片并记录切片总数（N’）,按等距随机方法每10张切片抽选1张行免疫组化染色（即切片抽样分数f=1/10）,采用VIS体视学系统测量所抽选切片的面积（A）和实际厚度（H）。根据卡瓦列里原理分别估计每个组织块在包埋、切片、染色过程中的皱缩系数（CC）。结果:正常肝组织与纤维化肝组织经包埋、切片与染色等处理后产生的皱缩系数分别是61.8%±8.33%与55.2%±13.8%,即包埋、切片与染色使正常肝组织与纤维化肝组织分别皱缩了（1-皱缩系数）:38.2%±8.33%与44.8%±13.8%。其中,包埋过程产生的皱缩系数分别约为77.5%±10.3%与70.0%±18.6%,即包埋使肝组织分别皱缩了（1-皱缩系数）:22.5%±10.3%与30.0%±18.6%。切片和染色过程产生的皱缩系数分别是79.7%±2.14%与80.0%±26.3%,即切片和染色使包埋后的肝组织分别进一步皱缩了20.3%±2.14%与20.0%±26.3%。两组之间各皱缩系数的差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.石蜡包埋、切片与免疫组化染色后正常肝组织与纤维化肝组织均会出现一定程度的组织皱缩,体视学形态定量研究时需考虑到组织皱缩对结果的影响。2.肝纤维化所致肝组织结构的改变对肝组织经包埋、切片与免疫组化染色等组织处理后产生的皱缩系数无显著影响。第二部分体视学研究肝纤维化大鼠肝组织内胶原纤维等重要结构的体积变化及异甘草酸镁的作用目的:运用体视学方法分别在光镜和电镜下研究CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝组织中胶原纤维体积及肝血窦、窦周隙等其他重要结构体积变化,以及MgIG对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝组织中胶原纤维体积及其他重要结构体积的影响。方法:研究对象同第一部分。造模结束后经内眦静脉取血以检测大鼠肝功。从每只大鼠肝脏等距随机抽选4个肝组织块制作石蜡切片,行Masson三色染色。采用体视学设备计数Masson三色染色切片上落在肝组织内胶原纤维及其他重要组织结构上的测点数及测点总数。落在肝组织内各结构上的测点总数与所有切片内的测点总数之比,即为肝组织内各结构在肝脏中的体积分数,将之乘以肝脏总体积,即得肝脏内各结构的总体积。另从每只大鼠肝脏随机抽选5个大小约1mm³的组织块制作电镜超薄切片,在透射电子显微镜下观察,并在1200倍放大倍数下随机抽选视野拍照。采用点计数测得肝组织内各超微结构在肝脏中的体积分数,将之乘以肝脏的总体积,即可得到各超微结构的总体积。结果:1.各组大鼠血清中ALT、AST与ALP的表达水平与对照组比较,模型组的AST、ALT和ALP的表达水平均显著升高（P<0.05）,治疗组AST和ALP的表达水平显著升高（P<0.05）,而ALT的表达水平无显著性变化（P>0.05）。模型组和治疗组的AST、ALT与ALP的表达水平之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。2.各组大鼠肝脏内胶原纤维等重要结构的总体积对照组、模型组和治疗组大鼠肝组织分布在小叶间的胶原纤维总体积分别是（18.1±20.1）mm³、（161±150）mm³和（189±136）mm³;分布在小叶内窦周隙的胶原纤维总体积分别是（37.8±30.0）mm³、（707±731）mm³和（595±167）mm³。与对照组比较,模型组大鼠肝脏小叶间胶原纤维总体积增加了7.90倍,小叶内窦周隙的胶原纤维总体积显著增加了17.7倍,窦周隙总体积显著增加了1.64倍,窦周隙内新生幼稚细胞总体积显著增加了8.61倍,肝血窦总体积显著减少了48.5%。与对照组比较,治疗组大鼠肝脏小叶间胶原纤维总体积显著增加了9.44倍,小叶内窦周隙的胶原纤维总体积显著增加了14.7倍,窦周隙总体积显著增加了2.43倍,窦周隙内新生幼稚细胞总体积显著增加了20.8倍,肝血窦总体积显著减少了49.7%。与模型组比较,治疗组大鼠肝脏内窦周隙内新生幼稚细胞的体积显著增加了1.27倍,而小叶间胶原纤维总体积、窦周隙内胶原纤维总体积、窦周隙总体积以及肝血窦总体积均无显著性变化（P>0.05）。结论:1.CCl₄诱导大鼠肝组织内小叶间与小叶内窦周隙的胶原纤维总体积均显著增加,本实验成功建立了大鼠肝纤维化模型。2.肝纤维化大鼠肝组织内小叶间与小叶内窦周隙的胶原纤维总体积增加的比例均可反应肝组织纤维化的程度。3.肝纤维化大鼠肝组织内胶原纤维总量的增加以窦周隙为主,因此窦周隙内胶原纤维增加可能是决定肝纤维化程度的关键因素之一。4.MgIG可促进新生幼稚细胞增殖,但对肝纤维化大鼠肝功能损害和胶原纤维增加无明显的抑制作用。第三部分体视学研究肝纤维化大鼠肝脏内肝星状细胞数量和体积的变化及异甘草酸镁的作用目的:运用体视学方法分别在光镜与电镜下探讨CCl₄诱导的肝纤维化大鼠肝组织中HSCs数量和窦周隙中HSCs体积变化,以及MgIG对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝组织中HSCs数量与窦周隙中HSCs体积的影响。方法:研究对象同第一部分。从每只大鼠肝脏等距随机抽选4个2 mm厚的肝组织块制作石蜡包埋切片,行结蛋白免疫组化染色显示HCSs。采用体视学技术——光学体视框估计各组大鼠肝脏内HSCs的总数。另从每只大鼠肝脏随机抽选5个大小约1mm³的组织块制作电镜超薄切片,在透射电子显微镜下观察,并在1200倍放大倍数下随机抽选视野拍照。采用体视学技术——点计数方法估计窦周隙中HSCs的体积分数,将之乘以肝脏的总体积,即可得到窦周隙中HSCs的总体积。结果:1.与对照组比较,模型组大鼠肝脏中HSCs数量与窦周隙中HSCs体积分别显著增加了1.99倍与3.82倍。2.与对照组比较,治疗组大鼠肝脏中HSCs数量与窦周隙中HSCs体积分别显著增加了2.62倍与3.07倍。3.与模型组比较,治疗组大鼠肝脏中HSCs数量与窦周隙中HSCs体积均无显著变化（P>0.05）。结论:1.CCl₄诱导的肝纤维化的形成可能与HSCs的活化和增殖有关。2.MgIG无明显抑制HSCs活化和增殖的作用。