RAD18是一种与单链DNA结合的RING结构蛋白,具有泛素E3连接酶作用。RAD18基因在DNA损伤修复中具有多方面的功能[1],同时在蛋白降解[2]、基因转录调控中也起作用[3]。目前有关RAD18基因的DNA损伤修复功能研究主要集中在体细胞和肿瘤细胞上,对其在动物胚胎发育过程中是否也具有相同的作用尚不清楚。为此,本研究首先建立了以H202为DNA损伤诱导剂的小鼠胚胎DNA损伤模型,而后采用RNA干扰技术,将RAD18基因shRNA病毒颗粒注入到小鼠受精卵中,通过qRT-PCR及免疫荧光技术分析小鼠早期胚胎中RAD18基因及DNA双链断裂(DSB)指标(γH2AX和ρATM)的表达变化,初步探索RAD18基因在小鼠早期胚胎DNA损伤修复中的作用。研究结果可为阐明胚胎DNA氧化损伤修复机制及提高体外培养胚胎质量奠定基础。1.RAD18基因在小鼠早期胚胎中的表达及小鼠胚胎DNA损伤模型的建立为了研究RAD18基因在小鼠早期胚胎DNA损伤修复中的作用,本实验首先采用qRT-PCR及免疫荧光方法分析了RAD18基因在小鼠早期胚胎发育过程中的表达规律。而后以H202作为DNA损伤诱导剂,观察不同浓度H202对小鼠胚胎发育的影响,并通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM的表达及H202导致的胚胎DNA损伤情况,以构建小鼠胚胎DNA损伤模型。结果发现,小鼠植入前各发育阶段胚胎均有RAD18基因表达,与1-细胞期胚胎相比,其在2-细胞、8-细胞期小鼠胚胎中的表达较高(P<0.01),在桑葚胚和囊胚中的表达水平显著下降(P<0.01)。H202处理对小鼠胚胎发育具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H202处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率均呈下降趋势。其中,KOSM(-)对照组、1.5μM、1.8μM、2.1μM、2.4μM组小鼠胚胎的分裂率分别为87.96%,77.95%,53.69%,45.55%,36.98%；囊胚率分别为49.89%,48.82%,19.21%,2.29%,0%。免疫荧光检测结果显示,KOSM(-)对照组中2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数(Foci number)多于1-细胞期胚胎,pATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和pATM在1.5μM和1.8μM组的1-细胞期胚胎中均未检测到；2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到pATM。2.1μM和2.4μM组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和pATM表达,其中2AμM组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μM组同时期的胚胎,说明2.1μM和2.4μM H2O2可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象。qRT-PCR分析结果发现,随着H202处理浓度的提高,RAD18基因在小鼠早期胚胎中的表达水平随之显著上升(P<0.01)。2.RAD18基因表达抑制对小鼠早期胚胎发育及DNA损伤修复的影响为深入探究RAD18基因在小鼠早期胚胎DNA损伤修复中的作用,在已建立的小鼠胚胎DNA损伤模型基础上,采用显微注射方法将RAD18基因shRNA病毒颗粒注射到小鼠受精卵中,分析RAD18基因表达抑制对小鼠胚胎发育及早期胚胎DNA损伤修复的影响。结果发现,不同H202处理浓度组内注射组与未注射组相比,注射shRNA病毒颗粒后,1.5μM组小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均升高,但差异不显著(P>0.05)；1.8μM组小鼠胚胎的分裂率显著升高(P<0.05),囊胚率差异不显著(P>0.05)；2.1μM组小鼠胚胎的分裂率显著升高(P<0.05),囊胚率下降,差异不显著(P>0.05)；2.4μM组小鼠胚胎的分裂率升高,差异不显著(P>0.05),囊胚率不变。以上结果说明抑制RAD18基因表达可提高H202处理组小鼠胚胎的分裂率,对囊胚发育率的影响效果不一样。免疫荧光检测结果显示,2.1μM和2.4μM组的小鼠胚胎注射RAD18基因shRNA病毒颗粒后,无论是1-细胞还是2-细胞期胚胎,γH2AX焦点数均降低；pATM蛋白在注射病毒颗粒前后均有表达,无显著变化。结果说明RAD18基因与胚胎DNA氧化损伤相关。以上结果说明,RAD18基因在小鼠植入前胚胎中均有表达。RAD18基因表达抑制可提高H202处理组小鼠胚胎的分裂率,并与胚胎DNA氧化损伤相关。