HER-2/neu编码产物p185是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。抗HER2人源化单克隆抗体是一种可与HER2受体胞外区特异性结合、抑制细胞增殖,使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性因子更敏感的单克隆抗体,可用于治疗过量表达HER2受体的肿瘤。　　 毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是一种较完善的外源基因表达系统,具有易于高密度发酵,表达基因稳定整合住宿土基因组中,能使产物有效分泌并进行糖基化修饰,培养经济等优点。目前,采用该表达系统已经成功表达了多种外源蛋白,包括一些单链抗体和抗体片段,但是对于全抗体表达的研究还很少。我们以抗HER2人源化单克隆抗体为模型,研究了全抗体在毕赤酵母中的表达情况,并对表达产物进行结构分析和活性测定。现将主要工作总结如下:　　 1.按照Genbank上报道的抗HER2人源化单克隆抗体轻重链序列以及毕赤酵母偏爱密码子,设计并合成了抗HER2人源化单克隆抗体轻链和重链的基因全序列。　　 2.得到的抗HER2人源化单克隆抗体轻链和重链的基因全序列经过酶切连接到pAO815和pPIC9载体中,构建了一系列表达载体。　　 3.制备了毕赤酵母感受态细胞,将重组表达载体通过电击转化到感受态细胞中,通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,首次在巴斯德毕赤酵母中成功实现了抗HER2人源化单克隆抗体的分泌表达,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L。　　 4.为了提高抗体的表达量.初步研究了基因整合方式、启动子、信号肽等因素对抗体表达水平的影响。结果表明.适当的基因整合方式能够有效地提高全抗体的表达量,组成型启动子GAP的表达效率与诱导型启动子AOX1相当,HSA信号肽能够明显提高重链的分泌量,最终我们选用了GAP启动子和HSA信号肽,获得了一株高效表达菌株,摇瓶表达水平达到93.4±9.1mg/L。　　 5.酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体能利用ProteinA亲和层析柱纯化。纯化蛋白分别进行了还原及非还原SDS-PAGE分析,PNGF酶切,WesternBlot分析以及蛋白的N端氨基酸测序,结果显示,酵母表达抗体的轻链和重链能够自发通过二硫键装配成结构正确的全抗体分子。该抗体分子的重链发生了N-糖基化,也有可能发生O-糖基化。　　 6.经过细胞活性测定,毕赤酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可较明显地抑制高表达p185erbB2的细胞株的生长。这提示毕赤酵母表达的HER2人源化单克隆抗体具有结合HER2受体胞外区并抑制肿瘤细胞生长的活性。　　 本研究在毕赤酵母中成功表达了抗HER2人源化单克隆抗体,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。