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炭疽菌属真菌是重要的植物病原菌,具有广泛的寄主范围。哈锐炭疽菌(C.horii)侵染柿树,是柿树上的一种毁灭性病害,给柿树产业常带来严重的经济损失。C.horii在侵染柿树的过程中,具有活体和死体营养阶段,在与寄主互作的活体阶段形成界面基质,界面基质把真菌细胞壁和寄主的原生质膜分开,这与活体营养型真菌与寄主的互作模式相类似。活体营养发展到一定阶段后转为死体营养阶段,引起病害。哈锐炭疽菌与寄主的互作体系已成为研究真菌—寄主互作分子机制的重要模式。随着炭疽菌属真菌C.higginsianum和C.graminicola基因组和转录组测序、注释和分析完成,这些研究为揭示哈锐炭疽菌与寄主的互作机制提供了重要参考。本研究通过收集哈锐炭疽菌不同发育阶段的样品,提取RNA,纯化mRNA后,建立cDNA文库,纯化扩增后,运用Illumina测序平台进行双末端测序。测序获得的reads采用Trinity组装、Blastx搜索和与同属测序真菌C.higginsianum和C.graminicola的同源性分析等生物信息学方法进行分析。另外,本研究还对对测序基因组DNA的提取条件进行了探究优化。获得的主要结果如下: 1、通过转录组测序、组装,获得了41,492个高质量的转录本(平均长度991bps),经过去冗余后得到35,482个unigenes基因(平均长度796bps)。 2、通过同源性分析,对获得的unigenes基因进行注释和评价:(1)用BLASTx(E-value<1.0E-5)程序,将unigenes与NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)中的 NR(non-redundant protein)、 Swiss-prot和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)三个数据库进行搜索,有21,079个unigenes匹配到NR库中16,981个推测的基因通道号上,11,503个unigenes匹配到Swiss-prot库的8,501个编码蛋白的基因通道号上,6,101个unigenes匹配了KEGG库中3,153个代谢途径上的基因。(2)比较三个库中匹配上的基因数量,三个库中共享2,969个基因,其中,NR和Swiss-prot数据库共享4,700个独特的基因,Swiss-prot和KEGG数据库共享184个独特的基因,而NR和KEGG库中无共有基因。 3、通过GO(Gene Ontology)分类分析,11,297个unigenes被指派到GO的三大目录上,即细胞组分、分子功能和生化过程。去冗余后,8,355个unigenes被指派到81,124个GO号上,这些GO号进一步被指派到53个亚目录中。4、C.horii与参考基因组比较:(1)建立本地Blast搜索,比较C.horii转录组的unigenes与同属C.higginsianum和C.graminicola基因组中的基因关系。10,188个unigenes同源于7,932个C.graminicola的基因,10,393个unigenes同源于C.higginsianum基因组7,411个基因,22,882个unigene无对应的同源性基因。(2)用Blastp,在uniprot数据库中搜索C.horii的unigenes、C.higginsianum和C.graminicola基因组注释的蛋白。C.horii有12,719个unigenes匹配到8,506个已知蛋白序列上。比较三个种中已知蛋白数量关系,C.horii有4,016个独特的蛋白,三个种共享3,378个已知蛋白,C.horri与C.graminicola共享3,901个已知蛋白,与C.higginsianum共享3,967个已知蛋白。以上结果表明,C.horii含有更多的独特基因。 另外,为了获得满足基因组测序建库要求的DNA,还对基因组DNA的提取条件进行了优化研究。用C.horri,R.solani,P.drechsleri三种不同类型的真菌,从菌丝培养方法以及蛋白酶K和其它试剂进行处理,结果表明,C.horri孢子接种液体培养DNA产量最高,而R.solani和P.drechsleri液体培养DNA产量较高。0.5mg/mL的蛋白酶K可提高三种真菌基因组产量和大小;山梨醇也能够提高DNA的产量,但PVP和月桂酰肌氨酸钠无作用或甚至降低产量。