论文部分内容阅读
草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）属于花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus），SVBV为环状双链DNA病毒，基因组结构与花椰菜花叶病毒（CaMV）相似，包含7个ORF，也含有2个启动子。SVBV全长启动子P1位于ORF VI基因下游，与CaMV35S启动子的位置相同，驱动ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF V基因的转录；ORF VI基因的转录由一个独立的启动子sP驱动，类似于CaMV的19S启动子。本研究进一步分析了SVBV2个启动子的驱动活性、驱动外源基因在植物中的表达模式以及驱动外源基因表达的稳定性。另外，本研究还分析了SVBV ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF V基因编码的蛋白对全长启动子P1的调节作用。1SVBV各启动子驱动gus基因瞬间表达的组织化学染色将pINT P1、pINT P2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121各表达载体电击转化的农杆菌分别注射本氏烟茎杆，组织化学染色并制备石蜡切片。显微观察发现，维管组织和部分皮层组织均能观察到蓝色位点，说明各启动子均能驱动gus基因在植物细胞中表达。2SVBV各启动子驱动gfp基因的瞬间表达和荧光活性观察将SVBV P1、SVBV P2、SVBV P3、SVBV P4和SVBV P5各启动子分别与载体pCHF3gfp基因前的35S启动子置换，获得植物表达载体pCHF P1、pCHF P2、pCHFP3、pCHF P4和pCHF P5，电击转化农杆菌，菌液分别注射本氏烟茎杆，制备茎杆注射区徒手切片。荧光显微镜观察发现，各植株维管组织均能观察到绿色荧光，说明各启动子均能驱动gfp基因在植物细胞中表达。从各切片的绿色荧光强度上来看，pCHFP1中gfp基因的表达水平要高于阳性对照pCHF3。注射未转化载体的农杆菌菌液，茎杆切片中几乎观察不到绿色荧光。3转基因普通烟gus基因mRNA的Real-time PCR检测Real-time PCR检测pINT P1和pINT121转基因普通烟gus基因的mRNA积累量，结果表明，pINT P1和pINT121转基因普通烟gus基因的mRNA积累量均显著高于非转基因普通烟，pINT P1转基因普通烟gus基因的mRNA积累量显著高于pINT121转基因普通烟，说明SVBV P1启动子的驱动活性很高，且超出35S启动子的驱动活性。4SVBV各ORF表达载体的构建及其对全长启动子P1调节作用构建SVBV中国分离物各ORF植物表达载体pBIN-ORF I、pBIN-ORF II、pBIN-ORF III、pBIN-ORF IV、pBIN-ORF V和pBIN-ORF VI，电击转化农杆菌，将含有各表达载体的农杆菌分别和含有表达载体pINT P1的农杆菌等量混合，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法定量分析gus表达活性，结果显示pBIN-ORF II和pBIN-ORFV分别与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性均显著高于pINT P1单独浸润，pBIN-ORFIV与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性显著低于pINT P1单独浸润，pBIN-ORF I、pBIN-ORF III、pBIN-ORF VI分别与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性与pINT P1单独浸润均无显著差异。结果表明，ORF II和ORF ORF V编码蛋白均能提高P1启动子的驱动活性，ORF I、ORF III、ORF VI编码蛋白对P1启动子驱动活性没有影响，ORF IV编码蛋白降低P1启动子的驱动活性。5SVBV亚启动子初步鉴定克隆SVBV中国分离物和美国分离物的亚启动子sP-cn和sP-us，分别置换pINT121载体gus基因上游的35S启动子，获得植物表达载体pINT sP-cn和pINTsP-us，电击转化农杆菌，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法测定结果表明，pINT sP-cn和pINT sP-us的平均相对gus活性极低，与未注射本氏烟相比没有显著差异，说明这2个亚启动子基本没有驱动活性。