多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。其特征为骨髓浆细胞瘤和一株完整性的单克隆免疫球蛋白(IgG,IgA,IgD或IgE)或Bence Jones蛋白质(游离的单克隆性κ或γ轻链)过度增生,临床常伴有多发性溶骨性损害,高钙血症,贫血,肾脏损害,易感染等特点。MM发病机制复杂,研究表明遗传学、免疫、细胞因子均与其发生、发展相关。表观遗传学是近年来受到医学研究者关注的肿瘤研究热点。肿瘤抑癌基因(Tumor suppressor gene, TSG)启动子区CpG岛超甲基化使之转录沉默在肿瘤的发生发展中起着重要作用。肝癌缺失基因-1(Deleted in liver cancer 1, DLC-1)是1998年Yuan[1]等在多个肝癌细胞系研究中新发现的TSG。甲基化特异性聚合酶链反应(Meathylation special PCR, MS-PCR)研究表明,多种实体瘤中包括肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、前列腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、神经胶质瘤[2]等存在DLC-1 CpG岛异常甲基化,且是其表达降低或缺失的主要机制。多种实体瘤肾透明细胞癌[3, 4]、卵巢上皮癌[5]、肝癌[6, 7]患者血清或癌组织DLC-1表达及临床意义研究结果显示DLC-1与癌症的发生、浸润和转移密切相关。在血液肿瘤中已被证实在急性淋巴细胞性白血病(Acute lymphoblast lecumia, ALL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphomas, NHL)中其启动子区异常甲基化比例超过80%[8-11]。对NHL[12]、MM[13]细胞株研究表明DLC-1在血液肿瘤中也发挥抑癌功能。但关于其在MM患者表达、甲基化及其与临床特征的相关性研究,目前研究报道尚少。本研究分别以MM患者及骨髓瘤细胞株U266为研究对象,对DLC-1在MM患者及U266细胞株的表达、甲基化及生物学功能进行了系列研究,并构建其转录本1的GFP真核表达载体,为后期其在细胞中的定位、功能及调节通路研究奠定了实验基础。第一章DLC-1在MM中的表达及意义目的:以初治MM患者为研究对象,分析DLC-1在MM患者中的表达,并结合临床特征分析其临床意义,为MM临床诊断、治疗、预后判断提供思路及实验基础。方法:根据DLC-1转录本2 mRNA设计特异性引物,运用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR, RT-PCR)技术,检测DLC-1在MM患者中的表达,并结合MM患者各临床指标包括HB、BUN、LDH、β2-MG、IgG、IgM、KAP、LAM、ALB、Cr、骨髓浆细胞比例进行相关分析,分析其临床意义。结果:Real-time PCR数据经溶解曲线结果及凝胶电泳验证为有效数据,MM患者组△Ct为9.93±2.97,与对照组7.55±3.0比较,两者存在统计学差异,表明MM患者DLC-1表达降低或缺失。进一步比较MM患者各分期、分级DLC-1表达,结果显示各组间DLC-1△C t值无统计学差异,可能是病例样本量少,分型、分期数据呈偏态分布,缺乏MGUS或冒烟性MM,大多数患者为III期,II期病例仅2例,病例数不足以代表特征群体。DLC-1表达与临床各种预后相关指标的相关分析显示,DLC-1表达△Ct值与HB、BUN、LDH、β2-MG、IgG、IgM、KAP、LAM相关性分析无统计学差异;而与血清ALB呈明显负相关(r=-0.324, P=0.031);与Cr(r=0.502, P=0.04)及骨髓浆细胞比例(r=0.474, P=0.03)呈明显正相关。而△Ct值越高,表明DLC-1表达越低。上述研究结果提示DLC-1表达降低可能在判断MM预后中具有一定意义,尚需扩大样本进一步研究。结论:DLC-1在MM患者表达降低或缺失,MM患者△Ct值与血清ALB呈明显负相关(r=-0.324,P=0.031);与Cr(r=0.502,P=0.040)及骨髓浆细胞比例(r=0.474,P=0.03)呈明显正相关。关于DLC-1表达降低在判断MM预后中的意义尚需扩大样本进一步研究。第二章MM患者DLC-1基因甲基化及临床意义研究目的:从DNA甲基化方面进一步对DLC-1在MM中表达降低或缺失的表观遗传学机制进行研究,并分析其临床意义。方法:运用生物信息学在线软件,DLC-1转录本2启动子区存在CpG岛,设计甲基化/非甲基化特异性引物及亚硫酸氢盐测序引物,运用巢式甲基化特异性PCR(Nest methylation specific PCR, nMSP)检测MM患者及正常对照者DLC-1甲基化状态,并用亚硫酸盐测序PCR(Bisulfate sequencing PCR, BSP)方法对部分MM患者甲基化状态进行验证,以检测结果可靠性。MM甲基化状态与临床特征进行相关性分析。结果:25例MM患者,甲基化比例为48%(12/25),其中1例为完全甲基化状态,余均为部分甲基化状态,而正常对照组不存在甲基化,差异有统计学意义(P<0.05)。甲基化比例较song[14]等报道(78%)较低,分析其原因,可能是检测方法中未针对骨髓瘤细胞进行分选后再研究。对DLC-1甲基化进一步分层研究显示Durie-Salmon分期IIa+IIIa期与IIIb之间、Cr正常和升高患者间、骨髓浆细胞比例≧ 50%组与<50%组间DLC-1甲基化比例存在统计学差异(P均<0.05)。另外DLC-1甲基化与DLC-1表达水平之间也存在联系。甲基化与临床指标中BUN、Cr及骨髓浆细胞比例呈正相关,说明DLC-1甲基化和肾功能损害程度及肿瘤负荷相关,在MM疾病进展及预后判断中可能起着一定作用。和DLC-1表达的相关性分析也显示,DLC-1甲基化程度越高,△Ct越高,则DLC-1表达越低。进一步说明了DLC-1甲基化在DLC-1表达缺失中的作用。BSP进一步验证MSP检测结果,非甲基化状态的1例正常对照者和1例MM患者,3个克隆中扩增片段的35个CpG位点均为非甲基化状态;MSP检测结果为部分甲基化状态的1例MM患者,3个克隆中CpG位点甲基化呈现嵌合状态;而完全甲基化状态的1例MM患者的3个克隆,仅一个克隆显示有两个CpG位点为非甲基化状态外,其余CpG位点均处于甲基化状态,说明本实验nMSP扩增结果具有可靠性。结论:DLC-1在MM患者甲基化比例为48%。Durie-Salmon分期IIa+IIIa期与IIIb之间、Cr正常和升高患者间、骨髓浆细胞比例≧ 50%组与<50%组间DLC-1甲基化比例存在统计学差异(P均<0.05);DLC-1甲基化与临床指标中骨髓浆细胞比例、BUN、Cr、DLC-1表达△Ct呈正相关,说明DLC-1甲基化和肿瘤负荷及肾功能损害程度相关,在MM疾病进展及预后判断中可能起着一定作用,DLC-1甲基化是DLC-1表达降低或缺失的主要机制。第三章地西他滨对MM U266细胞株生物学行为及DLC-1甲基化的影响目的:本研究以骨髓瘤细胞株U266为研究对象,通过地西他滨干预,观察其对细胞生物学行为及DLC-1表达、甲基化状态的影响,明确DLC-1在MM中的作用,为寻找MM新的治疗靶点及有效药物提供思路。方法:联合细胞培养、Real-time PCR、nMSP、BSP方法检测骨髓瘤细胞株U266 Decitabine干预前后DLC-1表达及甲基化状态,并用MTT、平板克隆形成实验、FCM检测细胞周期、Transwell迁移及侵袭实验检测Decitabine干预对其增殖、迁移、侵袭能力的影响。结果:结果表明,U266细胞株DLC-1基因表达呈缺失状态。DLC-1基因启动子区CpG岛在U266细胞株呈现完全甲基化状态。通过一定剂量(0.8Mm、1.6mM)地西他滨干预,DLC-1基因可恢复表达,表明地西他滨作为特异的DNA甲基化转移酶抑制剂,可逆转DNA的甲基化过程,进一步BSP测序结果也证实了部分CpG位点由CG逆转为TG,使其甲基化比例由100%下降至82.9%。但当地西他滨达到一定浓度(3.2mM),由于细胞毒作用,肿瘤细胞DNA合成明显受抑,肿瘤细胞死亡,导致DLC-1表达降低。研究结果进一步证实了TSG DLC-1启动子区CpG岛的甲基化是其在MM细胞株U266细胞表达缺失的重要表观遗传学机制。结合地西他滨对U266细胞株生物学行为的影响结果,提示地西他滨干预U266细胞,使DLC-1表达恢复,从而抑制U266细胞增殖、侵袭、迁移能力;DLC-1在MM发生、发展中起着一定作用。结论:U266细胞DLC-1表达缺失,DLC-1基因启动子区CpG岛在U266细胞株呈现完全甲基化状态是其表达缺失的主要机制。地西他滨处理可恢复DLC-1表达,逆转其甲基化状态,瘤细胞增殖、迁移和侵袭力均受到抑制,其抑癌功能可能和DLC-1启动子区CpG岛去甲基化、表达恢复有关。第四章表达载体pEGFP-N1/DLC-1的构建及鉴定目的:本研究旨在构建人DLC-1转录本1 GFP表达载体pEGFP-N1/DLC-1,为研究DLC-1细胞内转位、后期功能及机制研究奠定实验基础。方法:以PCMV-SPORT6/DLC-1质粒为模板,扩增出DLC-1 cDNA ORF区片段,将其与pMD18 T vector连接,筛选阳性克隆提取质粒后以BamH1和Sal I双酶切,同时双酶切载体pEGFP-N1。酶切产物经凝胶回收纯化,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化E. coli DH5α感受态细胞,经复苏后,在含Kana的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果:挑取的LB固体培养基上的单菌落经单/双酶切、PCR扩增、测序鉴定,证实均为阳性克隆,即DLC-1与pEGFP-N1体外重组成功。DMRIE-C Reagent转染结果进一步验证了GFP融合蛋白形成,转染细胞效率达到70%以上。结论:采用体外重组技术,成功地将人DLC-1 cDNA插入了荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中,为后期其在细胞中的定位、功能及调节通路研究奠定了实验基础。