论文部分内容阅读
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7是从酸菜发酵液中分离出来的一株乳酸菌。该菌发酵过程中产生的细菌素Paracin 1.7,可以有效抑制多种G+、G-和酿酒酵母的生长。前期研究发现,枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)可以促进L.paracasei HD1.7产细菌素,但对B.subtilis促进L.paracasei HD1.7产细菌素的机理以及二者之间的生态关系仍然不清楚。本文以此为出发点,通过非接触性共培养,探索B.subtilis促进L.paracasei HD1.7的分子机制,明确二者种间群体效应的存在。首先,本课题确定L.paracasei HD1.7与B.subtilis共同的优势碳源和氮源。将L.paracasei HD1.7与B.subtilis分别接种在含有不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、山梨醇和甘露醇)和氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸铵和尿素)的基础培养基中进行培养,L.paracasei HD1.7和B.subtilis均在以葡萄糖为碳源的基础培养基中长势最好:L.paracasei HD1.7发酵液的OD600nm值最大,p H值最小且细菌素含量最大,分别为0.71±0.080、3.47±0.054和71.59±2.343 AU/m L;B.subtilis发酵液的OD600nm值最大,p H值最小,分别为0.615±0.025和5.55±0.030。L.paracasei HD1.7和B.subtilis均在以酵母浸粉为氮源的基础培养基中长势较好:L.paracasei HD1.7的发酵液OD600nm值最大,p H值最小且细菌素含量最大,分别为0.64±0.024、3.68±0.035和72.67±1.380 AU/m L;B.subtilis发酵液的OD600nm值最大,p H值最小,分别为0.55±0.001和4.95±0.048。因此,选择葡萄糖和酵母浸粉作为二者的共同优势碳源和氮源进行共培养试验。同时本课题建立了L.paracasei HD1.7与B.subtilis共培养的生态研究模型,并以L.paracasei HD1.7单独培养、添加外源信号分子AI-2(autoinduce 2,AI-2)、B.subtilis的单独培养为对照,研究B.subtilis诱导L.paracasei HD1.7产细菌素机制及二者种间关系。结果表明:(1)通过比较L.paracasei HD1.7单独培养、添加AI-2以及L.paracasei HD1.7与B.subtilis共培养的研究结果可以发现:在L.paracasei HD1.7添加AI-2和L.paracasei HD1.7与B.subtilis的共培养中,L.paracasei HD1.7的细菌素产量显著增加,较L.paracasei HD1.7单独培养分别提高了4.39%和4.54%。同样,在添加AI-2和L.paracasei HD1.7与B.subtilis的共培养中,L.paracasei HD1.7的群体感应相关基因lux S、prc K和prc R的转录水平也明显增加;较L.paracasei HD1.7的单独培养,lux S基因分别提高了7.74倍(24h)和2.72倍(36h);prc K基因分别提高了1.60倍和2.51倍(24h);prc R基因分别提高了3.00倍和3.11倍(24h)。这表明B.subtilis可以促进L.paracasei HD1.7细菌素产量和种内及种间群体感应基因转录水平的提高,而且B.subtilis可分泌一种与AI-2作用相同的信号分子,调控L.paracasei HD1.7细菌素生成的群体感应系统。(2)通过比较B.subtilis单独培养和B.subtilis与L.paracasei HD1.7共培养的研究结果可以发现:共培养8h时,B.subtilis的生长开始受到抑制,36h时完全被抑制并且整个培养过程中没有检测到芽胞。同样,B.subtilis的芽胞形成相关基因spo0A、sig E、sig F及sig G的转录水平明显降低(52%-92%)。这表明L.paracasei HD1.7抑制了B.subtilis的生长和芽胞形成。(3)利用i TRAQ技术结合LC-MS/MS/MS鉴定单培养和与B.subtilis共培养60h的L.paracasei HD1.7细胞中蛋白总数为1914种,筛选到差异蛋白329种,其中162种蛋白表达上调,167种蛋白表达下调。利用GO和KEGG对差异蛋白进行生物信息学分析,表明差异蛋白表达涉及氨基酸生物合成、双组份调控系统、ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统等多条代谢通路。综上研究结果说明,L.paracasei HD1.7与B.subtilis共培养时,B.subtilis能促进L.paracasei HD1.7的生长、细菌素产量的增加和群体感应基因的上调表达;利用i TRAQ技术建立L.paracasei HD1.7共培养和单培养差异蛋白表达体系,差异蛋白涉及氨基酸生物合成代谢、双组份信号转导系统、ABC转运蛋白代谢和磷酸转移酶系统,说明共培养条件下促进细菌素的合成可能与启动双组份调控系统。L.paracasei HD1.7则抑制B.subtilis的生长、芽胞的形成和芽胞形成相关基因的表达。因此可以看出,在营养丰富的情况下,L.paracasei HD1.7对B.subtilis形成一种偏害作用,而B.subtilis对L.paracasei HD1.7形成一种偏利作用。