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RNA干扰已经发展成为一种非常有潜力的肿瘤基因治疗手段。用于治疗的RNA干扰物质主要有化学合成siRNA和shRNA表达载体。在体内shRNA表达载体具有更稳定的RNA干扰作用，便于进行较长时间的基因功能研究。shRNA表达载体法分为病毒载体法和非病毒载体法两种。shRNA病毒表达载体的转染效率高，但安全性低。因此研究安全性较高的shRNA非病毒表达载体是很有必要的。 一、一种可同时表达多种shRNA的载体pCSH1的设计与构建 shRNA非病毒表达载体安全性高，但它转染效率较低。主要原因是质粒DNA难于从细胞质进入细胞核，可通过降低质粒的大小来改善。质粒DNA在细胞内可以促发干扰素效应，引起非特异毒性，可通过降低质粒的用量来解决。我们构建了用于治疗的shRNA非病毒表达载体pCSH1，在设计时注意了尽量提高RNA干扰的效率和尽量降低载体的非特异毒性两个问题。载体采用了pUC19的质粒基本序列，RNA聚合酶Ⅲ识别的H1启动子，以使载体尽量小。并将多个shRNA转录单位利用同尾酶的特性串联在一个质粒上，以使载体的用量降低。 为了验证pCSH1是否可以实现单个基因的RNA干扰，我们设计针对NRas和c-Myc的shRNA靶序列，分别构建入pCSH1，分别命名为pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3。并用RT-PCR和Western Blot检测质粒瞬时转染后的靶基因RNA水平和蛋白水平的变化。结果表明pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3可以特异性降低靶基因的RNA水平和蛋白水平。 为了验证pCSH1是否可以实现两个shRNA转录单位的串联，我们构建了针对肿瘤相关基因NRas同一位点的shRNA转录单位串联的载体pCSH1-2shN2，以及分别针对NRas和c-Myc的shRNA转录单位串联的载体pCSH1-shNM。生长曲线法实验表明相同质量的pCSH1-2shN2对HepG2细胞生长的抑制明显强于pCSH1-shN2。Western Blotting分析显示pCSH1-shNM既能有效抑制NRas又能有效抑制c-Myc的基因表达水平。我们还构建了含3～6个shRNA转录单位串联的载体，结果表明pCSH1能将多个shRNA转录单位串联在一个载体上。