猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前严重危害养猪业的传染病之一,该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的,其主要临床特征是怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍;仔猪与育肥猪有明显的呼吸道症状。至今为止,PRRS仍在全球大部分地区流行,是猪主要的传染病之一。2006年5月以来,我国暴发最初称为“高热综合症”的猪病,给我国的养猪业造成很大经济损失。多项研究已表明,变异的北美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)是该病的主要病原。但是到目前为止PRRSV毒力增强的机制还不清楚,因此,非常有必要建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的反向遗传学技术操作平台。本研究分别构建成功了HP-PRRSV HuN4和疫苗株F112的感染性克隆,并且构建了PRRSV的标记疫苗。本实验根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pG1SK载体上。在扩增5’末端时,引入sp6启动子序列用于后期的体外转录得到病毒的转录本,在基因组3’末段Poly(A)尾引入SwaI酶切位点用于线性化包含HuN4全长cDNA的质粒,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个MluI酶切位点作为鉴定拯救病毒的genomic marker。将含HuN4株基因组全长cDNA的质粒线性化后体外转录合成病毒RNA,转染BHK-21C细胞,24h后将细胞液上清接种Macr-145细胞,拯救出病毒。通过间接免疫荧光和检测genomic marker证明病毒拯救成功。比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及生物学特性没有显著差异。以上结果表明PRRSV强毒株HuN4株感染性克隆构建成功,为研究PRRSV的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。根据GeneBank中登陆的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株基因组序列设计并合成特异性引物,在扩增5′末端时引入sp6启动子核心序列,在基因组3′末段Poly(A)尾后引入NotI酶切位点用于线性化包含F112全长cDNA的质粒。应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV疫苗株F112全基因组cDNA,将扩增的各个cDNA重叠片段胶回收后先通过合适的酶切位点分别克隆到载体pG2SK,再逐一拼接成全长cDNA。将全长cDNA克隆线性化后体外转录合成病毒RNA,转染BHK-21C细胞,24h后将细胞液上清接种Macr-145细胞,拯救出病毒。通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,结果发现病毒学及生物学特性没有显著差异。结果表明F112感染性克隆构建成功,建立PRRSV疫苗株F112的反向遗传学技术平台,为探讨PRRSV的致病机制以及研制有效的标记疫苗奠定了基础。PRRSV感染时机体内可以产生滴度很高的针对于NSP2的抗体,许多NSP2的B细胞表位已经被鉴定出来。利用PRRSV疫苗株F112感染性克隆,将NSP2上的B细胞免疫优势表位(第430-454位氨基酸)缺失替换为鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19,构建标记疫苗株。通过体外转录,转染BHK21细胞,在Marc-145细胞上的传代,拯救出了病毒,通过RT-PCR测序和间接免疫荧光试验证明含遗传标记的突变株病毒拯救成功。试验结果表明PRRSV NSP2的B细胞表位(第430-454位氨基酸)对病毒的繁殖来说是非必须的,并且可以在NSP2区域插入外源表位进行表达,对于PRRSV新型疫苗的研制提供了基础数据和思路。