南极大磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶样酶分离纯化、酶学性质探索及其生物学活性研究

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南极大磷虾隶属于节肢动物门甲壳纲,是南极生态系统的关键物种,资源丰富,具有巨大的开发和利用潜力。国外研究表明,南极大磷虾体内含有多种蛋白酶,能清除机体坏死组织和细胞、治疗角膜碱烧伤和消除牙斑等,具有广泛的医学用途,而其体内蛋白酶活性40%来源于胰蛋白酶。因此,对其胰蛋白酶样酶进行分离纯化,酶学性质探索和生物学活性研究,具有一定的理论和应用价值。本文采用20-70%饱和度硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S100凝胶过滤柱层析和DEAE Sepharose-F.F离子交换柱层析,纯化得到一种胰蛋白酶TLEⅠ,分子量大约在30.0KDa,纯化倍数为3.19。胰蛋白酶酶学性质研究发现:酶促反应的速率受pH、温度影响。在37°C,以BApNA为底物的反应体系中,在较广泛的pH范围(3.011.0)内,酶具有活性,最适宜反应pH在7.09.0之间;在pH 8.0,以BApNA为底物的反应体系中,酶在较广泛的温度范围(4-80°C)内具有活性,反应最适宜温度为30°C50°C。Mg2+、Ca2+(00.5 mmol/L)对胰蛋白酶有一定的激活作用。Fe3+、Cu2+、Zn2+、丙三醇和丙酮对胰蛋白酶有一定的抑制作用。Mn2+、乙醇和二甲基亚砜在低浓度时对酶起激活作用,高浓度下表现为抑制作用。建立兔机械创伤模型,以提取的粗酶、纯化酶、木瓜蛋白酶和生理盐水分别涂抹伤口,以肉眼观察和伤口愈合面积为指标对比各组实验结果。结果显示,粗酶和纯化酶都有很好的效果,粗酶更佳。分别采用番泻叶、大黄、5-羟色胺(5-HT)建立小鼠腹泻模型1h后,以生理盐水为阴性对照,思密达为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg-1和40mg.kg-1)的南极磷虾蛋白酶制剂,统计6h内小鼠腹泻发生率和腹泻累积次数。结果显示,南极磷虾蛋白酶可显著降低番泻叶引起的小鼠腹泻次数,降低大黄,5-羟色胺引起的小鼠腹泻次数。采用右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,以生理盐水为阴性对照,柳氮磺胺吡啶为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg-1和40mg.kg-1)的南极磷虾蛋白酶制剂,通过肉眼及实体观察,EGF的测定,组织切片观察对比各组实验结果。结果显示:灌胃南极磷虾蛋白酶的小鼠在饮用DSS诱导UC后,能够保持良好的精神状态,少有便血现象,并能抑制小鼠体重的减轻;同时,南极磷虾蛋白酶能够明显提高UC小鼠血液中EGF表达水平,从组织切片结果来看,南极磷虾蛋白酶也能降低溃疡症状的发生,其作用效果在一定程度上与其浓度成正比。
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