登革病毒(Dengue virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒，有四个血清型(DENV1-4)，四型感染均可引起以发热为主的登革热(classical dengue fever,DF)和可威胁生命的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)。DENV感染机理至今尚未完全阐明，目前尚无安全有效的疫苗用于预防。不同血清型的DENV感染时，由于免疫应答不平衡而出现感染增强(antibody-dependent enhancement，ADE)，使得病程加重，在DENV感染中最为突出，也是DENV疫苗研制的最大障碍。　　我国大陆1940年以来，曾多次爆发DF的流行，但自1989年我国大陆普遍使用自主研制的流行性乙型脑炎病毒(Japaneses encephalitis virus，JEV)减毒活疫苗(live attenuated vaccine，LAV)SA14-14-2以来，在JEV感染得到预防的同时DENV感染病例也急剧减少，每年除部分散发和输入病例外，本土病例非常少见，重症病例则更为罕见。不同的是，与我国在陆路和海陆直接相邻的东南亚如越南、泰国等地也是JEV和DENV双重流行的国家，这些国家使用日本生产的JEV灭活疫苗(inactivated vaccine，INV)保护当地JEV感染的同时，每年DENV的发生率依然很高，其中重症DF高达20％-30％。已有研究表明，LAV和INV在诱导机体产生免疫保护作用方面可能存在差异，而这种差异导致其在交叉保护DENV感染过程中的作用可能不同。并且通过比对分析发现:JEV和DENVprM/E和internal gene(polymerase，NS5)的核苷酸序列同源性分别为53.8％和64％，表明两病毒具有相似的免疫原性和较近的亲缘关系，两者之间可能存在交叉性免疫保护作用。　　因此，本实验利用LAV、INV和自行设计的核酸疫苗pCAG-JME（表达JEVprM/E蛋白）免疫小鼠，从体液免疫、细胞免疫和保护性实验三个方面，比较几种JEV疫苗的免疫效果，以及对DENV的交叉免疫反应;并且在此基础上利用人JE患者血清和JEV疫苗接种者血清，进一步研究其与四型DENV的交叉反应，揭示这种交叉保护反应与中国大陆和周边国家的DENV流行趋势差异的关联，进而为DENV的预防提供新思路。本课题主要实验流程和结果如下:　　一、三种JEV疫苗LAV、INV和pCAG-JME诱导的免疫应答反应和保护作用的特点　　1.特异性anti-JEV抗体水平的检测　　免疫分INV、LAV和pCAG-JME三组，每组10只小鼠。在末次免疫后3周，分离血清，利用ELISA测定各组anti-JEVIgG抗体效价，结果显示，LAV和pCAG-JME疫苗组IgG抗体效价相同，均为1∶6400，而INV组IgG抗体效价仅为1∶1176，明显低于LAV和pCAG-JME组。同时，利用ELISA测定了各组小鼠免疫血清（1∶100稀释）的IgG抗体亚型，INV以IgG1升高为主，LAV以IgG2a上升为主，而pCAG-JME组IgG1和IgG2a抗体效价较为接近。此结果提示INV主要以Th2途径免疫（体液免疫）应答为主，而LAV主要以Th1免疫（细胞免疫）应答为主，pCAG-JME组两种免疫应答途径没有差别。　　2.特异性anti-JEV中和抗体水平的检测　　Anti-JEV抗体特别是中和抗体，在JEV感染过程中，发挥重要的保护作用，因此本研究采用噬斑减少中和实验（PRNT）进一步检测了中和抗体的产生情况。结果显示LAV组中和抗体(PRNT50)效价最高，为1∶235，其次为pCAG-JME组，INV组最低，分别为1∶93和1∶54，说明LAV组和pCAG-JME组较INV组小鼠血清更具中和JEV的能力。　　同样检测了攻毒后血清的中和抗体滴度，pCAG-JME组和LAV组攻毒后中和抗体(PRNT50)滴度明显上升，分别高达1∶2298和1∶1159，而INV组与攻毒前比较上升不明显，仅为1∶80，说明LAV和pCAG-JME诱导了较好的记忆性B细胞反应，抵抗JEV的攻击。　　3.淋巴细胞增殖实验和CTL检测　　末次免疫后3周处死小鼠，收集脾细胞，体外培养并以JEV浓缩病毒抗原进行刺激，与pCAGGSP7组相比，pCAG-JME组和LAV组均显示了一定的淋巴细胞增殖反应，但无统计学差异;在此基础上，以病毒感染的L929细胞作为靶细胞，体外经病毒抗原刺激后的脾细胞作为效应细胞，进行CTL测定，结果发现CTL活性上升趋势不明显，提示本实验条件下，CTL在宿主抵御JEV感染过程中并不发挥主要作用。　　4.细胞因子检测　　末次免疫后3周处死小鼠，收集脾细胞，采用ELISPOT检测细胞因子的分泌水平。与pCAGGSP7组相比，INF-γ水平在三个疫苗组均有上升，但LAV组和pCAG-JME组的INF-f水平明显高于INV组;IL-2在LAV组呈现升高趋势，而在INV组和pCAG-JME组无明显变化;同样，IL-4因子水平三个疫苗组均有明显上升，并且LAV组高于其他两个疫苗组;同时我们检测了IL-10和IL-17的水平。INV组IL-10明显升高，与其他两个疫苗组比较有统计学差异。已知IL-10不仅是Th2型免疫反应的一个指标，更重要的是，IL-10是公认的抑制性细胞因子，INV组IL-10明显升高可能与其诱导的有限免疫应答相关;同样pCAG-JME组Th17明显升高，说明Th17途径亦参与了pCAG-JME组免疫应答反应。　　5.树突状细胞(DC)成熟度和Treg细胞数量检测　　末次免疫后3周处死小鼠，取全血检测小鼠DC成熟度（活性）和Treg细胞的扩增数量。代表DC成熟度的四种细胞表面标志物(CD40、CD86、CD80和MHC-Ⅱ)在pCAG-JME组均无明显变化;LAV组和INV组，虽然CD40和CD86无明显变化，但CD80和MHC-Ⅱ类分子表达明显下降，与pCAGGSP7组相比差异显著(p＜0.05)，提示LAV组和INV组DC活性的下降。结合细胞因子的检测结果，在LAV组虽然CD80和MHC-Ⅱ两种表面标志物的表达量明显下降，但IL-10水平未升高;而INV组CD80和MHC-Ⅱ下降的同时伴有IL-10明显升高，说明LAV组和INV组DC活性下降的机制可能不同:LAV组DC活性下降可能与病毒的复制有关，而INV组可能是升高的IL-10抑制了DC的成熟，进而从抗原呈递环节抑制了免疫应答反应。　　进而利用FACS四标法分析了三个疫苗组小鼠外周血中Treg细胞特异性表面标记物的变化。与LAV组和pCAG-JME组比较，INV组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分数显著升高(p＜0.05)。这一结果与DC活性以及IL-10的检测结果一致，提示DC表面共刺激分子（CD80和MHC-Ⅱ）表达水平下调可能诱导了Treg细胞的产生，从而导致免疫应答反应的不充分或免疫耐受。　　6.小鼠保护性实验　　末次免疫三周后，利用致死量的JEV进行腹腔攻毒，攻毒后21天内每日观察发病情况和病死率。结果发现对照组pCAGGSP7组死亡9只，存活率为10％;在整个观察期LAV组小鼠未呈现任何发病症状，存活率为100％;pCAG-JME组仅1只小鼠于第4天出现弓背、耸毛、运动迟缓等症状，第6天死亡，其余小鼠未见发病，存活率为90％;INV组有7只小鼠相继发病、死亡，存活率为30％。可见INV疫苗的保护效果明显低于LAV组和pCAG-JME组，这一结果与特异性抗体水平、IL-10、DC活性以及Treg检测结果一致。　　二、JEV疫苗对DENV的交叉保护作用的研究　　1.DENV交叉IgG抗体检测　　BALB/c小鼠在末次免疫3周取血，分离血清，利用ELISA方法测定各组血清与DENV1-4型交叉反应性抗体的效价:　　DENV1:pCAG-JME组小鼠产生了较高的与DENV1交叉反应性抗体，平均几何滴度为1∶733;LAV组次之，INV组最低，分别为1∶519和1∶436;　　DENV2:pCAG-JME组小鼠产生了较高水平的DENV2交叉反应性抗体，平均几何滴度为1∶1393;而INV组次之，为1∶857;LAV组最低，为1∶264;　　DENV3:pCAG-JME组小鼠产生较高水平的与DENV3交叉反应性抗体，平均几何滴度为1∶1481;LAV组次之，为1∶1372;而INV组最低，为1∶1008;　　DENV4:pCAG-JME组的小鼠产生了较高水平的与DENV4交叉反应性抗体，约为1∶459;LAV组次之，为1∶424;INV组最低，约为1∶373。　　综上:pCAG-JME组对DENV1-4均产生了较高水平的交叉反应性抗体，而LAV疫苗组诱导产生的与DENV1、DENG3、DENV4的交叉反应性抗体水平高于INV疫苗组;对DENV2而言，INV组产生的与其交叉反应的抗体水平高于LAV组。　　2.DENV交叉中和抗体水平的检测　　末次免疫后3周，分离血清，利用空斑减少中和实验（PRNT）测定三组小鼠血清与四个血清型DENV的交叉中和抗体效价。　　DENV1:pCAG-JME和LAV组与DENV1交叉中和抗体效价较高，分别为1∶160和1∶113;而INV组产生的交叉中和抗体效价较低，仅为1∶30;　　DENV2:各组血清均产生了较高交叉中和抗体效价，以pCAG-JME组最高，约为1∶593;INV组和LAV组，分别为1∶403和1∶74;　　DENV3:其中pCAG-JME和LAV组中和抗体效价较高，分别为1∶61和1∶59;而INV组较低，约为1∶23。　　DENV4∶LAV组最高，约为1∶71;pCAG-JME组次之，INV组最低，分别为1∶54和1∶17;　　上述结果提示，pCAG-JME与DENV1-4均有较高的交叉中和抗体，LAV组对DENV1、DENV3和DENV4交叉中和抗体效价明显高于INV组，而INV组与DENV2的交叉抗体水平较高。　　3.细胞因子检测　　以四型DENV为刺激抗原，采用ELISPOT分析各组小鼠脾细胞细胞因子的分泌水平。　　DENV1抗原刺激:三个疫苗组的IFN-γ、IL-2水平均明显升高;INV组IFN-γ水平高于LAV组(p＜0.05);INV组和pCAG-JME组IL-4水平明显上升;IL-10因子水平三组升高最明显，其中LAV组明显高于INV组和pCAG-JME组，达1.4倍。　　DENV2抗原刺激:INV组IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10均明显上升，提示INV组同时诱导了体液免疫应答和细胞免疫应答反应;pCAG-JME组仅IL-4有明显上升;LAV组可见IL-10水平升高，但明显低于INV组(p＜0.01)。　　DENV3抗原刺激:三个疫苗组的IFN-γ和IL-10水平均有明显升高，其中LAV组最高，pCAG-JME组次之，INV疫苗组最低，且LAV与INV的组间差别有统计学意义(p＜0.05);INV组和LAV组IL-2和IL-4均有升高，水平相近(p＞0.05)。　　DENV4抗原刺激:INV组和LAV组IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平均明显升高，并且LAV组IL-2和IL-10因子水平明显高于INV组(p＜0.05);pCAG-JME组仅有INF-γ和IL-10的升高，其幅度较LAV和INV组为低。　　以上细胞因子水平的变化说明三种疫苗免疫后的小鼠在DENV1、DENV3、DENV4抗原刺激下可以同时诱导细胞免疫应答和体液免疫应答，且LAV诱导的免疫应答反应明显优于于INV组;在DENV2刺激下的结果略有不同，LAV组和pCAG-JME组对DENV2诱导的交叉反应以体液免疫应答反应为主，而INV组同时诱导了细胞免疫应答和体液免疫应答反应，对DENV2而言，INV组诱导交叉免疫应答反应明显优于LAV组。　　4.交叉保护性实验　　末次免疫后小鼠分别用致死量的四型DENV脑部注射，观察小鼠发病和死亡情况。　　DENV1攻毒:pCAGGSP7组小鼠与感染后7天左右发病，渐重，与第18天全部死亡，死亡率为100％;正常对照组于第16天死亡9只，存活1只，死亡率为90％;INV组所有小鼠均在感染后9天左右发病，其中有3只小鼠发病症状逐渐缓解，7只死亡，存活率为40％，存活的小鼠中，有2只遗留严重的神经系统后遗症（双后肢瘫痪）;pCAG-JME组和LAV组对DENV1的交叉保护能力较高，小鼠分别于10-11天左右发病，第13天和14天出现死亡，最终存活率分别为60％和50％;存活小鼠中各有一只有轻微后肢瘫痪症状。DENV1攻毒结果说明，LAV和pCAG-JME对DENV1的交叉保护作用优于INV。　　DENV2攻毒:pCAGGSP7组于23天死亡9只，存活一只，死亡率90％;正常对照组第19天全部死亡，死亡率为100％;LAV组共死亡5只，最终存活率为50％;INV组和pCAG-JME组发病和死亡时间比LAV组明显延迟，存活率均为60％，存活小鼠未见后遗症症状。DENV2攻毒结果说明，INV和pCAG-JME对DENV2的交叉保护作用优于LAV。　　DENV4攻毒:正常组全部死亡，pCAGGSP7对照组存活一只，该两组的死亡率分别为100％和90％;INV组第13天死亡2只，其余8只发病3天后逐渐恢复正常，最终存活率为80％;LAV组和pCAG-JME组未见发病，存活率为100％。DENV4攻毒结果说明，LAV和pCAG-JME对DENV4产生了较好的交叉保护作用，并且优于INV。　　（注:DENV3攻毒正在进行中）　　三、JE患者血清对DENV有交叉中和作用　　14例JE患者血清抗JEV中和抗体效价主要集中在1∶40-1∶320，其中有一例高达1∶1280;14例血清中有13例抗DENV2交叉中和抗体效价＞1∶10，主要集中在1∶20-1∶40之间，其中有1例高达1∶160;检测的8例抗DENV3交叉中和抗体效价均＞1∶10，主要集中在1∶10-1∶20，其中有2例达到1∶40;同样的，10例抗DENV4交叉中和抗体效价，有4例＜1∶10，5例为1∶10，仅有一例为1∶20;同时发现抗DENV交叉中和抗体效价的高低和抗JEV抗体效价没有明显相关性。　　四、JEV疫苗接种者血清对DENV有交叉中和作用　　利用LAV和INV接种者血清，我们检测了2种免疫血清对DENV2和DENV3的交叉中和抗体效价，结果发现:(1)INV组和LAV组对DENV2的交叉中和抗体效价(PRNT50)大都分布在1∶20-1∶80，并且两组之间无明显差别;(2)2种免疫血清对于DENV3的交叉中和抗体效价有所不同，INV组PRNT50多集中在1∶40-1∶80，其中1∶40所占比例为66.7％，而1∶80为16.7％;LAV组较多集中在1∶40-1∶160，其中1∶80所占比例最高，约为43.2％，1∶40和1∶160分别为21.6％和18.9％。INV组和LAV组的平均抗体效价分别为1∶50和1∶81，可见LAV组产生的平均中和抗体效价高于INV组。　　综上所述，我们认为(1)LAV和pCAG-JME在小鼠实验中诱导产生了很好的JEV特异性免疫应答反应，而INV诱导产生的免疫应答反应较弱，DC细胞活性的下调和Tregs细胞的上调可能是INV免疫应答反应较低的主要原因;(2)pCAG-JME对于DENV1-4型都产生了最高的交叉保护作用，LAV对DENV1、DENV3和DENV4型的交叉保护作用优于INV，而INV对DENV2型交叉保护作用优于LAV;(3)JEV患者血清检测到对DENV的交叉中和抗体效价，提示JEV感染者血清对DENV的感染有抑制作用;(4)INV和LAV接种者血清，同样对DENV产生了＞1∶10的交叉中和抗体效价，并且对于DENV2，LAV和INV平均抗体效价没有明显差别，而对于DENV3，LAV的平均抗体效价高于INV，结合动物实验以及国内外DENV流行现状，提示LAV的使用是DENV在中国大陆流行趋势明显降低的原因之一。本研究结果为DENV的设计和DENV的预防提供了新思路。