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乙醇进入人体后,通过乙醇脱氢酶代谢为乙醛,再通过乙醛脱氢酶代谢为乙酸。乙醛脱氢酶2（Aldehyde dehydrogenases 2,ALDH2）可有效的将乙醇代谢产生的乙醛水解,从而保护人体的肝脏等器官,减少乙醛对人体的危害,是非常有前景的解酒用蛋白酶。但是,通过大肠杆菌发酵制备出的重组ALDH2通常是以包涵体的形式存在,没有活性。同时,野生型的乙醛脱氢酶2易被消化道内常见的蛋白酶所水解。本研究拟通过对野生型ALDH2进行突变设计,将胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶切位点突变成其他氨基酸,以期提高对胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用的耐受,并通过在ALDH2表面引入亲水性氨基酸,在内部引入疏水性氨基酸,促进重组ALDH2的正确折叠,从而获得在大肠杆菌内可溶表达的突变型ALDH2,具体研究如下:1.突变设计:通过Rosetta软件对乙醛脱氢酶2进行突变设计,在乙醛脱氢酶2的氨基酸序列中,将胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶切位点突变,以增强对胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用的抗性。将其表面的疏水性氨基酸突变成亲水性氨基酸,以增加乙醛脱氢酶2的表面亲水性。将底物和辅酶NAD+结合位点周围的氨基酸进行适当突变,增强底物、辅酶NAD+与周围氨基酸残基之间的相互作用,提高乙醛脱氢酶2的稳定性和催化活性。同时,引入少量突变,纠正酶的主链结构,以保证催化中心的正确构象。根据Rosetta打分结果,我们选取了十个能量较好的突变结构,将序列送去生物公司进行基因合成,并克隆到pET44b质粒,转入BL21（DE3）宿主中,用于后续的重组蛋白制备。2.重组蛋白的表达:通过对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度的筛选,寻找最佳的诱导条件。研究结果表明,最适IPTG浓度为0.5 mM,最适诱导温度是37℃,诱导5 h后表达量达到最大。野生型ALDH2以包涵体的形式存在,而突变型蛋白中一部分为可溶表达。其中,重组蛋白DE-852、DE-64、DE-49、DE-1437中可溶表达的ALDH2含量较高,DE-143、DE-1179和DE-1013为少量可溶表达,而其余重组蛋白仍为包涵体。通过Western Blot鉴定,蛋白条带为目的蛋白ALDH2。3.重组蛋白的纯化:采用Ni2+-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白,通过改变平衡缓冲液中咪唑的浓度来优化纯化条件。研究表明,当使用含有20 mM咪唑的平衡缓冲液时,得到的目的蛋白较多,杂蛋白基本被去除。经超微量紫外可见光光度计测定重组蛋白浓度,突变蛋白DE-852、DE-1437、DE-64、DE-143、DE-1179、DE-49和DE-1013的回收率分别为11.9%、35.7%、36.5%、31.6%、29.4%、29.6%、32.8%和30.2%。野生型ALDH2的蛋白纯度为72.67%,突变蛋白DE-852、DE-64、DE-49和DE-1013的纯度都高于野生型ALDH2,纯度分别为94.08%、92.75%、90.17%和87.64%。而突变蛋白DE-143、DE-1179和DE-1437的纯度较低,分别为50.43%、59.45%和43.98%。4.稳定性研究:采用人工胃液和人工胰液,对野生型ALDH2和突变蛋白的稳定性进行了对比研究。在80μg/mL的人工胃液中,可溶表达的突变蛋白与野生型蛋白相比,稳定性明显提高,野生型ALDH2从60 min开始,逐渐被水解,而突变蛋白在90 min之内都可以稳定存在。在2μg/mL的人工胰液中,突变蛋白的稳定性显著提高,野生型ALDH2在15 min时已经被胰蛋白酶水解,而在突变蛋白中,DE-49和DE-1437可以稳定存在约60 min,其余突变蛋白则可以稳定存在90 min而不被降解,说明通过对胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切位点的突变,可以明显提高ALDH2在消化液中的稳定性。对酶的最适反应温度及pH值进行了优化,结果表明,突变蛋白的最适pH值为8.5,30℃时酶活性达到最高。在最佳反应条件下,野生型ALDH2酶活性为1.21 U/mL,突变蛋白DE-852、DE-64、DE-143、DE-1179、DE-49、DE-1013和DE-1437的酶活性为0.70 U/mL、0.57 U/mL、0.51 U/mL、0.37 U/mL、0.61 U/mL、0.47 U/mL和0.39 U/mL。热稳定性研究表明,在不超过40℃时,野生型ALDH2和突变蛋白的稳定性较好。本研究通过突变设计改变了野生型ALDH2的氨基酸序列,优化了表达及纯化条件,得到了表达量和纯度都较高的突变蛋白,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶表达,提高了ALDH2在消化液中的稳定性,为基于乙醛脱氢酶的蛋白药品和解酒产品的开发奠定了基础。