论文部分内容阅读
背景目前认为三磷酸腺苷（Adenosine-5’-triphosphate,ATP）是神经系统中重要的信号分子之一,P2X7受体（P2X7R）是介导ATP毒性作用的主要受体,生理浓度（微摩尔水平）下,ATP激活P2X7R形成阳离子通道,可非选择性地介导Ca2+、Na+内流,K+外流等,参与一系列生理作用,如调节递质释放、修饰突触和营养神经等作用[1-3]。然而,胞外高浓度ATP反复刺激P2X7R则可以形成“膜孔”,允许各种阳离子及NMDG+、YO-PRO-1等900D以下的大分子物质通过[4,5],产生细胞毒性作用,引起细胞凋亡、坏死。有研究显示,在脑损伤中,P2X7R过度活化可以增加细胞外Ca2+内流,诱发Ca2+超载[6],加重脑组织损伤,介导神经元凋亡和坏死。在中枢神经系统急性中毒性损伤、创伤性损伤、脊髓损伤、中风等动物实验中,应用孕酮（Progesterone）疗法可延缓模型动物的神经细胞坏死和凋亡,减轻炎症反应以及缺血性脑损伤导致的脑水肿,促进脑神经髓鞘的合成,促进血脑屏障重建[7-9],并且能改善与年龄有关的痴呆（阿尔茨海默病）、降低癫痫等神经退行性病变的发生与发展[10-20]。至今脑损伤治疗仍是人类面临的极大难题,临床上缺乏理想的干预方法和手段,孕酮或许能为患者带来一丝希望。既然ATP浓度升高是多种中枢或外周神经元继发性损伤时的普遍现象,孕酮对神经元继发性损伤的保护作用也已得到证实。那么,研究孕酮调控P2X7R膜孔激活就具有特别的理论意义。本实验试图通过观察孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响,探讨孕酮神经元保护作用的机制,为其临床应用提供实验依据。目的观察高浓度ATP对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的影响,探讨孕酮抗ATP诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响及相关机制。方法1细胞存活率的测定1.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,吹打成细胞悬液,以5×l04/m L的细胞密度种置在96孔培养板中,在5%CO2,37℃细胞培养箱中培养24 h,随机分为4组:（1）空白组:无细胞,只含培养基。（2）正常对照组:SH-SY5Y细胞常规培养,无ATP处理（0 m M ATP）。（3）ATP组（分别用1、3、5、7 m M ATP）。孵育2 h后,以正常对照组的存活率为100%,CCK-8法检测该细胞在不同ATP浓度作用下的存活率。1.2 SH-SY5Y细胞实验处理方法同上,分为6组,正常对照组、ATP组、孕酮（10、30、100、300 n M）+ATP组。孕酮预孵育30 min,然后加入5 m M ATP处理2 h,使孕酮存在于整个反应体系中。以正常对照组的存活率为100%,CCK-8法测各组中的细胞存活率。2检测SH-SY5Y细胞膜孔形成2.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,吹打成细胞悬液后,以5×l04/m L的细胞密度种置于96孔培养板中,随机分组为:正常对照组、ATP组（l、3、5、7 m M ATP）。ATP作用2h,将YO-PRO-1（2μM）加入该体系中孵育l h,经酶标仪检测各组的荧光强度。2.2取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,以5×l04/m L的细胞密度培养于96孔培养板中,随机分组为:正常对照组、ATP组、ATP+KN-62（P2X7受体拮抗剂）组、ATP+孕酮组。其ATP为5 m M,孕酮为30 n M,KN-62为500 n M。孕酮或KN-62先孵育30 min后,ATP作用2h,将YO-PRO-1（2μM）加入该体系中孵育l h,经酶标仪检测各组细胞的荧光强度。3 Furo-3/AM检测细胞内游离Ca2+浓度3.1取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,吹打成细胞悬液后,以5×l04/m L的细胞密度种置于96孔培养板中,随机分为4组:0、1、3、5 m M ATP,各组均分别作用15、30、60 min,Hank’s溶液洗涤3次,加终浓度含5μM Fluo 3-AM和2μM Hoechst 33342的无血清、无酚红H-DMEM培养液,37℃孵育30 min。荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度变化。3.2取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,吹打成细胞悬液后,以5×l04/m L的细胞密度种置于96孔培养板中,随机分为4组:正常对照组、ATP组、孕酮+ATP组、KN-62+ATP组。其ATP为5 m M,孕酮为30 n M,KN-62为500 n M。孕酮或KN-62先孵育30 min后,ATP作用2 h,然后Hank’S洗涤细胞3次,加终浓度含5μM Fluo 3-AM和2μM Hoechst 33342的无血清、无酚红H-DMEM培养液,37℃孵育30min。荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度变化。4 SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的检测取对数生长期分化良好的SH-SY5Y细胞,随机分成3组:正常对照组、5 m M ATP组、30 n M孕酮+5 m M ATP组。提取细胞膜蛋白,BCA法测定蛋白质浓度,Western blotting检测SH-SY5Y细胞P2X7受体表达水平。结果1 SH-SY5Y细胞存活率的测定1.1不同浓度的ATP作用2 h对SH-SY5Y细胞存活率的影响以正常对照组细胞存活率为100.0%,CCK-8法检测结果:1、3、5、7 m M ATP组存活率分别为80.4%,71.7%,56.1%,36.2%,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。随胞外ATP浓度增高,细胞存活率逐渐降低,呈剂量依赖性。1.2孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响以细胞正常对照组存活率为100.0%。ATP组细胞存活率为56.1%。3 n M孕酮+ATP组、10 n M孕酮+ATP组、30 n M孕酮+ATP、100 n M孕酮+ATP组细胞存活率分别为62.8%,64.6%,74.4%,59.7%,与单纯ATP组相比均有明显差异（P>0.05）。孕酮在保护ATP诱导的SH-SY5Y细胞的损伤中具有浓度依赖性。2检测SH-SY5Y细胞膜孔形成2.1 ATP诱导SH-SY5Y细胞膜通透性的变化以胞内YO-PRO-1荧光强度为指标,观察ATP对SH-SY5Y细胞通透性的影响。以对照组YO-PRO-1的荧光强度为100.0%,1、3、5、7 m M ATP组分别是103.5%,108.6%,120.5%,140.6%,与对照组比较差异均有统计学意义（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）,且表现出浓度依赖性的特征。2.2孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞膜孔形成的影响荧光显微镜下观察胞内YO-PRO-1荧光强度,结果,5 m M ATP组明显强于正常对照组,而孕酮（PROG）+ATP组和KN-62+ATP组荧光信号明显低于ATP组。多功能酶标仪检测也有类似结果,经孕酮或KN-62先作用于30 min后,再给予ATP处理2 h,细胞内的荧光强度分别为103.9%、98.23%,均明显低于ATP组120.5%（P<0.01）,而与正常对照组无显著差别（P>0.05）。3孕酮对细胞内游离Ca2+浓度的影响正常SH-SY5Y细胞在不同时间内钙离子含量及分布较稳定。随着ATP组作用的延长,平均荧光值的对数值逐渐增高,即胞内钙离子逐渐增高。孕酮（PROG）+ATP组和KN-62+ATP组与ATP组相比较,细胞内钙离子明显降低（P<0.05）。4孕酮对ATP诱导的SH-SY5Y细胞P2X7受体表达的影响5 m M ATP处理2 h后SH-SY5Y细胞P2X7受体蛋白表达明显增加（P<0.05）,而预先给予30 n M孕酮（PROG）预孵育30 min后,再加ATP作用2 h,P2X7受体蛋白表达水平则显著低于ATP处理组（P<0.05）。结论KN-62可以降低ATP介导的SH-SY5Y细胞对YO-PRO-1的摄入、胞内游离钙离子的上升、提高细胞存活率,说明P2X7受体在ATP诱导的SH-SY5Y细胞死亡中起着重要作用;孕酮有相似于P2X7受体拮抗剂“KN-62”的作用,能显著抑制ATP诱导的细胞膜孔形成,降低细胞内Ca2+浓度,提高细胞存活率。