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铁死亡是一种具有铁依赖性的新型程序性细胞死亡模式。其特征表现在于细胞内谷胱甘肽依赖的抗氧化系统的失活以及脂质过氧化物的大量蓄积。目前研究表明铁死亡与众多严重威胁人类生命健康的疾病的发生发展密切相关。因此,阐明铁死亡发生发展过程中的分子机制,寻找其潜在的作用靶点将会对铁死亡相关疾病的诊疗提供新的应对思路。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4,GPX4）是一种抗氧化酶,可催化多种过氧化物的还原反应,维持机体内脂质活性氧的平衡,从而保护细胞免受过氧化物的损伤。研究表明,GPX4是铁死亡的关键负调控因子,可通过水解脂质过氧化物,清除细胞内积累的过氧化物和氧自由基。因此,在肿瘤细胞中,如何通过抑制GPX4的表达或酶活性,从而通过增强铁死亡促使癌细胞的死亡,是值得期待的癌症治疗新策略。泛素化是一种广泛存在的翻译后修饰,在细胞内发挥重要的生物学调控作用。底物蛋白由多种酶催化,特异性地发生泛素化修饰,进而在蛋白酶体中被识别和降解。近年来,翻译后修饰在铁死亡中的作用受到科学家的广泛关注。研究发现,去泛素酶抑制剂在触发铁死亡的过程中伴随了GPX4蛋白的降解。另外,在视网膜内皮细胞中,高糖处理可以通过Trim46（tripartite motif-containing 46）调控GPX4的泛素化修饰水平。值得思考的是,Erastin作为铁死亡诱导剂是否也可以通过Trim46介导GPX4的泛素化修饰,从而调控铁死亡过程,这正是本论文想要探讨和回答的科学问题。为此,本研究以HEK293T为细胞模型,先用Erastin和其它铁死亡调控剂处理细胞后,通过检测铁死亡相关指标来判断铁死亡发生情况,然后通过检测Trim46对GPX4的蛋白稳定性、GPX4的泛素化水平以及GPX4的潜在泛素化位点的影响等,明确Trim46对GPX4蛋白的泛素化调控作用及分子机制;阐明Erastin是否通过Trim46介导GPX4的泛素化修饰,从而调控细胞的铁死亡。本研究结果将为以铁死亡调控相关关键因子为作用靶点的肿瘤靶向干预策略提供新的理论依据。其相关工作总结如下。首先,为了明确Erastin对铁死亡及Trim46表达的作用,我们将不同浓度Erastin单独或与铁死亡其他调控剂联合使用,通过ROS、MDA、GSH检测、CCK-8以及Western Blot等方法,确定了Erastin可以诱导293T细胞发生铁死亡,降低细胞的增殖能力,并伴有Trim46蛋白表达量的上调。第二,为了明确Trim46与GPX4之间的潜在关系,我们购买了PC3.1-Flag-Trim46质粒,通过更换载体构建了PC3.1-Trim46,建立过表达Trim46、Flag-Trim46系统,并分组加入蛋白酶体抑制剂MG132处理,检测GPX4蛋白表达水平,结果表明过表达Trim46会下调GPX4的蛋白稳定性。第三,为了明晰Trim46是否能够直接介导GPX4的泛素化修饰,我们通过成功构建的PC3.1-Flag-GPX4质粒,建立过表达Flag-GPX4系统,在293T细胞中单独或联合转染Flag-GPX4与PC3.1-Trim46载体,通过Flag IP检测Trim46与GPX4的相互作用关系,MG132处理后泛素化IP检测GPX4的泛素化水平,实验结果表明Trim46能够与GPX4直接相互作用,并且可以促进GPX4泛素化水平的上调。第四,为了确定Trim46介导GPX4泛素化调控的分子机制,首先根据Phosphositeplus网站预测GPX4的潜在泛素化位点,构建GPX4的去泛素化点突变质粒（K107R、K126R、K167R和K191R）,Western Blot方法验证点突变载体构建成功,同时泛素化IP结果提示K191位点是Trim46催化GPX4发生泛素化修饰的调控位点。第五,为了检测Erastin抑制GPX4表达的可能机制,我们将Erastin与MG132单独或联合应用,Western Blot结果发现,Erastin处理能够降低GPX4蛋白的稳定性;为确定Erastin对GPX4的泛素化降解的影响,我们在293T细胞中瞬时转染Flag-GPX4及HA-Ubi载体,并用MG132处理细胞,Flag IP结果显示,Erastin可以诱导GPX4的泛素化降解;为了进一步阐明Erastin抑制GPX4表达与Trim46介导的GPX4泛素化调控有关,我们在293T细胞中单独或联合转染过表达的Trim46及GPX4载体,并采用Erastin处理,Western Blot及Flag IP结果显示,Erastin可以通过Trim46催化GPX4的泛素化降解。第六,为了明确Trim46-GPX4通路在Erastin诱导铁死亡中的作用,我们在293T细胞中转染过表达的Trim46载体,采用Erastin处理,并通过过表达GPX4进行回复实验,通过检测ROS、MDA、GSH的含量以及MTT实验证明Trim46-GPX4通路在Erastin诱导细胞铁死亡中发挥重要作用。综上所述,推测Erastin可以通过Trim46催化GPX4 K191位点的泛素化修饰,调控GPX4泛素化降解以及诱导细胞发生铁死亡。本篇论文得到的实验结果将为后续研究铁死亡相关疾病治疗中的潜在靶点提供新的视角。