粘细菌是一类具有复杂的细胞间协同行为的革兰氏阴性细菌,能够在不利环境下形成多细胞子实体并分化产生抗逆性粘孢子,在固体介质表面通过双运动系统的协同进行滑动运动,自然环境中具有群体捕食行为,是原核生物细胞信号调控和进化研究的重要模式材料,另外,粘细菌可以产生种类多样、结构和作用机制新颖的次级代谢产物,被公认为是继放线菌之后又一个重要的药源微生物新类群。除粘细菌外的其他变形菌门δ分支细菌基因组在3.66到5.01Mb之间,而Myxococcus xanthus DK1622基因组为9.14Mb,与推断的δ分支祖先基因组相比有了4到5Mb的扩增。M. xanthus营养生长阶段细胞含有1到2个基因组拷贝,进入稳定期后,染色体拷贝数降为1,发育成子实体的粘孢子含有两个完整的染色体拷贝,如果抑制DNA复制会延迟M. xanthus的发育过程,然而确切的基因组扩增与发育之间的调控关系及其机制目前还未知。粘细菌遗传操作体系的发展比较滞后,在过去的将近半个世纪中,发展了包括普遍性转导、接合以及电转化等手段将质粒导入粘细菌受体细胞,而自主复制质粒的缺乏,使得可以应用的质粒只能以整合到染色体上的方式存在于粘细菌细胞中,这种局面极大限制了粘细菌的研究和应用。直到2006年,本实验室与中国科学院植物生理生态研究所合作发现了来自于Myxococcus fulvus 124B02的自主复制环形质粒pMF1,并基于pMF1复制区构建了Escherichia coli-M. xanthus穿梭载体pZJY41和pZJY156,为粘细菌遗传学深入研究翻开了新的篇章。环状质粒复制机制主要包括三种类型：theta复制、链取代复制和滚环复制。其中,链取代复制和滚环复制中间体都产生单链DNA,而theta复制则不产生单链复制中间体。通常,质粒复制起始需要质粒编码的Rep起始蛋白,宿主起始因子装配的位点和富含AT的开链区,有些质粒还含有一个或多个dnaA盒和多个Dam甲基化序列。很多质粒ori区内含有称为重复子(iterons)的若干正向重复序列,是Rep蛋白的结合位点,同时还有调控复制的作用。除此之外,有些质粒会产生反义RNA,它们与目的RNA,即正义RNA,序列互补,发生顺式或反式作用,反义RNA对质粒复制进行负调控。本论文以pZJY156和pZJY41的pMF1 ori区为基础,对pMF1的复制起始方式、复制区组成形式及其性质进行研究。首先,采用PEG6000沉淀法提取了M.xanthus DZ1 pZJY41的复制中间体,将提取产物同时进行两块琼脂糖电泳,分别将这两块琼脂糖胶经过碱变性和不经过碱变性处理,将DNA通过毛细管法转移到尼龙膜上,用标记了地高辛的pMF1.14基因的片段作为杂交探针进行杂交,杂交结果显示,M. xanthus DZ1的pZJY41复制中间体不含有单链DNA,即,在M. xanthus DZ1中,pZJY41的复制过程中不产生单链DNA,这表明,在粘球菌中,pMF1的复制采取了theta复制方式进行,这种方式是大部分革兰氏阴性细菌中质粒的复制方式。由于穿梭载体pZJY156中,含有2.2kb的pMF1插入片段(11645-13853),该序列中只包含有pMF1.14一个完整的ORF,推测pMF1.14蛋白即是质粒复制必须的复制起始蛋白。生物信息学预测结果暗示pMF1.13、pMF1.14和pMF1.15可能以共转录的操纵子形式存在,通过提取124B02菌株的总RNA,用同一条引物进行反转录反应,以该反转录产物为模板对三个目的基因进行RT-PCR验证,结果表明,三个基因位于同一条mRNA上,即它们确实是以共转录的操纵子形式存在的,并将其分别命名为repA、repB和repC基因,这个操纵子不同于repABC模型,可能该操纵子具有其特有的复制和调控形式。在E. coli-M. xanthus穿梭载体pZJY156及其包含的pMF1 ori区基础上,研究pMF1 ori区的关键因子的基本性质。首先,企图通过大肠杆菌异源表达体系表达pMF1的推断的质粒复制起始蛋白,即pMF1.14蛋白,对该蛋白进行生物信息学分析,在GenBank数据库中搜索不到同源蛋白,并且不包含典型的DNA-蛋白质作用的HTH基序,pMF1.14蛋白的理论等电点为9.85,为碱性蛋白,尝试表达了带有组氨酸标签的全长蛋白,蛋白表达为包涵体形式,其纯化效果不理想,不能得到可溶型的纯化蛋白,用GST助溶标签和pCold TF助溶体系表达全长蛋白,有可溶型表达,但其可溶型组分与亲和层析柱结合不理想,未得到纯化的蛋白；尝试将蛋白根据其二级结构截断表达,对其可溶型表达没有改善。在体外方法研究pMF1.14蛋白的DNA结合活性不成功的情况下,通过体内互补实验研究了该蛋白以及质粒顺式作用区的定位以及性质,证明了pMF1.14蛋白是质粒复制必须的反式作用的复制起始蛋白,pMF1的顺式作用区位于质粒DNA上pMF1.14 ORF的内部,定位了该顺式作用区的必须最小区域在12894～13263范围内,在该区域约380bp内,存在较其他部分密集的DNA重复序列,这些重复序列不是典型的iteron结构,结合pMF1.14结构的特殊性,推测pMF1.14与DNA的结合方式可能是一种较为特殊的作用方式。另外,在pMF1.13基因存在时,体内互补实验中,质粒的电转化效率和质粒的拷贝数有所提高,推测pMFl.13对pMF1.14的表达或者行使功能起到一定的促进作用。