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黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员,是世界上寄主范围最广的病毒。病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)是一快速高效的研究植物基因功能工具。本研究在前人的基础上,基于CMV-Tsh株系的RNA2构建基因沉默载体,选择不同的指示基因进行沉默效果分析,并成功构建CMV的农杆菌侵染性克隆。主要内容如下:
一、CMV-Fny假重组弱病毒组合的筛选
以CMV-Fny与CMV亚组Ⅰ中不同株系的RNA2(Cb7 RNA2、Can RNA2和Tsh RNA2)构建RNA2不同的假重组病毒,接种本氏烟。接种7天后,F1F2F3、F1C2F3、F1CNa2F3在寄主上均引起叶片皱缩、蜷曲的症状,而F1Tsh2F3在本氏烟上则引起轻花叶的症状反应,因此以CMV-Tsh RNA2作为构建VIGS载体母本。
二、基于CMV-TshRNA2的2b构建基因沉默载体
采用PCR以及双酶切等手段对CMV-Tsh RNA2进行了三种改造,构建Tsh的2b基因缺失95nt、完全缺失的TshRNA2,及在2b的终止密码子后,RNA2的UTR前引入MluⅠ和SnaBⅠ酶切等酶切位点,前两个载体分别命名为Tsh R23/42b、Tsh R2△2b,而Tsh RNA2的终止密码子后,RNA2的UTR前直接引入酶切位点构建而来的载体则命名为Tsh R22b。pTsh R23/42b、pTsh R2A2b以及pTsh R22b体外转录产物分别与CMV-Fny RNA1和FnyRNA3混合接种本氏烟,证实假重组病毒具有侵染活性后;在上述的克隆位点分别插入354pb大小的本氏烟PDS片段,体外转录接种后比较本氏烟的光漂白程度,最终确定pTshR23/42b为本研究的基因沉默载体作为进一步分析对象。
三、不同指示基因沉默效果的研究
pTsh R23/42b载体中插入PDS或Su基因部分片段以及绿色荧光蛋白基因(GFP)部分片段,分析寄主的光漂白、叶表黄化和转GFP本氏烟(16c)变红程度,并采用semi RT-PCR分析靶标基因在植株中的表达量。结果表明:F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3接种本氏烟后,植株叶表呈现明显的光漂白,F1Tsh R23/42b-Su351F3诱导本氏烟产生黄化现象,相应的植株中PDS和Su的表达量均下调;在UV lamp照射下,接种F1Tsh R23/42b-GFP217F3的16C植株则呈现发红,而接种F1Tsh R2～2bF3植株呈绿色,semi RT-PCR检测到植株中的GFP表达量下调。采用汁液摩擦接种的方法,分析F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3在本氏烟的稳定性,结果表明,转接15次,F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3均能稳定存在于寄主中,并使得本氏烟产生光漂白现象。
四、以启动子序列和大豆PDS为插入片段的沉默效应以及下调Beclin基因后转NN基因烟草对TMV的症状反应
在pTsh R23/42b载体中插入本氏烟PDS或GFP的启动子部分片段、大豆PDS部分片段(分别命名为proPDS、35s、GmPDS)以及Beclin基因部分片段,分析本氏烟的光漂白、16C变红程度、大豆的光漂白和NN基因烟草对TMV的症状反应。结果表明:本氏烟接种F1Tsh R23/42b-proPDS223F3后出现明显光漂白;16C接种F1Tsh R23/42b-35s120F3后,在UVlamp照射下呈现发红;在大豆的PDS被F1Tsh R23/42bGmPDS277 F3被下调表达后,植株呈现光漂白表型。转NN基因烟草(本氏烟和三生烟)接种F1Tsh R23/42b-Beclin346F3后,经过7天再接种TMV,转NN基因烟草出现系统性坏死,而对照病毒F1Tsh R23/42bF3接种的植株,TMV则引起枯斑症状。
五、CMV农杆菌侵染性克隆的构建以及应用
PCR扩增TSh R23/42b、Tsh R23/42b-NbPDS354、Tsh R23/42b-Su351、Fny RNA1、RNA2、RNA3全长序列,目的片段回收后将其克隆至瞬时表达载体pCB301中,阳性克隆转入农杆菌GV3101。通过农杆菌浸润接种本氏烟,分析农杆菌CMV-Fny,F1Tsh R23/42b-NbPDS353F3和F1Tsh R23/42b-PDS353 F3在本氏烟上引起的光漂白和叶表黄化现象。结果显示:农杆菌CMV-Fny引起的症状反应跟体外转录接种CMV-Fny相一致,而浸润接种F1Tsh R23/42b-NbPDS353F3和F1 pCB301-Tsh R23/42b-Su351F3的本氏烟分别出现光漂白和叶表黄化表型。