Hepatopoietin Cn(HPPCn)是我们实验室的研究人员发现的一个能够特异性促进肝细胞增殖的蛋白因子。HPPCn能促进肝细胞DNA合成和细胞分裂,以及70%肝脏切除小鼠的肝脏再生,并且对CCl4引起的大鼠肝纤维化具有保护作用。本研究探讨HPPCn对乙醇引起的慢性肝损伤的保护作用以及HPPCn在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)转移中与micro RNA(mi RNA,mi R)的调控关系及其对HCC转移的意义。一、HPPCn激活鞘氨醇激酶(Sph K)信号促进肝脏损伤修复作用和机制我国肝脏病发病率高,大量饮酒导致的肝纤维化和肝硬化患者数量也在逐年增多。长期酒精摄入还会引起肝细胞DNA某些区域发生表观遗传学改变,使正常肝细胞转化,从而具有干细胞或前体细胞性质,诱发HCC。因此寻找酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)新的干预靶点和治疗策略,具有极其重要的社会意义。本实验室前期的研究表明,重组人HPPCn蛋白(rh HPPCn)对乙醇引起的小鼠肝急性损伤具有保护作用,这种保护作用的发挥是通过缓解乙醇造成的氧化应激,减少脂质过氧化作用实现的。另外,最近的研究指出,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,Sph K)/1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)/S1P受体(S1P receptors,S1PRs)信号轴参与了肝脏损伤及纤维化。我们已有的研究结果显示,HPPCn可以激活肝细胞中Sph K信号通路。Sph K有两个异构体,即Sph K1和Sph K2,在短期乙醇饲喂造成的小鼠急性肝损伤模型中,给予携带Sph K1基因的重组腺病毒(Ad-Sph K1)的治疗效果与rh HPPCn蛋白的效果近似,这提示Sph K1/S1P/S1PRs信号轴可能介导了HPPCn对肝细胞的保护作用。本研究的目的之一是,在前期研究的基础上,利用肝脏特异性高表达HPPCn的转基因小鼠(HPPCnliver+/+)于体内考察HPPCn对乙醇引起的慢性肝损伤的保护作用,并对Sph K1/S1P/S1PRs介导HPPCn发挥保护作用的机制进行验证和分析。我们采用雄性HPPCn转基因小鼠建立长期乙醇饲喂模型,野生型(wild-type,WT)小鼠作为对照。小鼠被随机分入乙醇饲喂组(Et OH-fed)和对照饲喂组(Con-fed)。我们首先分析了小鼠血清中谷氨酸丙酮酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)的释放情况,观察了肝组织病理切片,以检测HPPCn对酒精引起的肝细胞的保护作用。然后我们检测了小鼠肝组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,分析HPPCn对乙醇引起的肝细胞脂质过氧化作用的影响。为考察小鼠肝脏纤维化程度,我们还分析了肝组织中的胶原沉积,并测定了肝脏中羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的含量,以及与纤维化相关的基因的表达。实验结果显示,HPPCn在转基因小鼠肝脏中特异性高表达。与对照组相比,HPPCn高表达能防止乙醇引起细胞转氨酶释放,改善肝组织病理改变,并能够防止乙醇引起的MDA含量的增加,说明HPPCn能够减少乙醇引起的脂质过氧化作用的发生,对乙醇造成的慢性肝损伤具有保护作用。而且,HPPCn转基因小鼠长期饲喂乙醇后,纤维化程度较对照组低,表现为较低的胶原沉积水平和Hyp含量,以及较低的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和前胶原α1(I)【Colα1(I)】表达水平。我们还进一步分析了小鼠Sph K1/S1P/S1PRs通路的表达情况。乙醇饲喂提高了HPPCn转基因小鼠肝脏中Sph K的活性和S1P的表达水平,但是对WT小鼠Sph K活性的影响不大,也没有明显提高WT小鼠肝脏中S1P的表达。在乙醇摄入的早期和后期,只有Sph K1在HPPCn转基因小鼠肝脏中的表达相对于Con-fed组及WT小鼠显著升高,Sph K2的表达没有明显改变。这些结果提示,HPPCn高表达与Sph K活性提高以及S1P增加相关。另外,S1PRs的表达显示,乙醇饲喂3日后,HPPCn转基因小鼠中S1PR3 m RNA水平上升。在野生型小鼠中,乙醇饲喂8周后S1PR2 m RNA水平明显下降,而在HPPCn转基因小鼠中在观察到相反的趋势,S1PR2 m RNA水平显著升高。我们认为这些结果提示,在急性和慢性肝损伤中HPPCn激活不同的S1PRs。除此以外,我们的研究还发现,HPPCn能够激活肝细胞中Sph K的激酶活性,进而增加Erk1/2的磷酸化,且这一作用具有S1PR3依赖性。二、HPPCn调控mi RNA 17-92影响肝癌发生发展的作用和机制本实验室的研究发现,在HPPCn转基因小鼠DEN诱导肝癌模型中,HPPCn在肝脏中特异高表达在诱导早期能增加原癌基因c-myc的表达,并明显增加肝癌细胞的肺转移率。Mi RNA作为一种非编码小分子单链RNA,在肝癌的发生发展中发挥重要作用。一些重要的mi RNA簇在肝癌细胞中也存在异常表达,它们通过调控P53,PTEN,c-myc等重要信号通路而参与肿瘤的发生和发展,已经成为肿瘤治疗的新型靶点。mi R-17-92基因簇是一个高度保守的基因簇,异常表达与多种恶性肿瘤的发生和转移相关,其参与调控肝癌细胞生物学特性的作用和机制还不清楚。我们推测HPPCn和c-myc以及mi R-17-92可能具有相关性。在此基础上,本研究的第二个目的是阐明HPPCn/c-myc/mi R-17-92在肝癌细胞生长和转移中的调控关系,系统分析HPPCn/c-myc/mi R-17-92信号在肝细胞癌发生及转移过程中的作用以及作为肝癌治疗靶点的可能性。为此,我们首先检测了HPPCn转基因小鼠肝癌组织的mi RNA表达谱,结果显示,HPPCn转基因小鼠肝癌组织与非转基因小鼠肝癌组织比较,mi R-17-92在HPPCn转基因鼠的肝癌组织中的表达显著增加。我们检测三者在HCC细胞系中的表达情况,并结合临床肝癌病人的标本观察来考察HPPCn、mi R17-92及c-myc的调控关系,并通过rh HPPCn及RNAi处理进行验证。然后我们利用慢病毒载体建立稳定高表达mi R-17-92的肝癌细胞系,并利用裸鼠皮下荷瘤实验和脾脏注射实验考察mi R-17-92对HCC细胞增殖和转移的作用。此外,我们建立mi R-17-92基因敲除动物模型,考察其在肝癌诱发中的作用。我们的结果显示,mi R-17-92的表达与HCC细胞的转移能力以及HPPCn和c-myc表达正相关。我们采用RNAi干扰敲低肝癌细胞中HPPCn的水平,发现mi R-19a,mi R-20和mi R-92的表达下调;而用rh HPPCn刺激肝癌细胞可以上调c-myc和mi R-17-92簇的表达;并且在敲低肝癌细胞中c-myc的表达后,HPPCn对mi R-17-92的上调作用消失。临床标本观察也显示,mi R-17-92在肝癌组织中高表达,并且HPPCn与mi R-17,mi R-18,mi R-19a,mi R-92密切相关。除此之外我们发现,慢病毒载体介导的mi R-17-92高表达对HCC增殖能力的影响不明确。然而,高表达mi R-17-92可以促进皮下移植瘤内的血管形成,而且mi R-17-92高表达可以显著提高HCC细胞的体外迁移能力和体内转移能力,在脾脏注射模型中,mi R-17-92高表达组出现较多的肝脏、肺脏以及腹腔转移。在本研究中,我们用mi R-17-92基因敲除小鼠建立肝癌诱发模型,发现mi R-17-92的敲除可以降低原癌基因c-myc和肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)的表达。本研究表明,HPPCn通过c-myc调控mi R-17-92及其下游靶基因,HPPCn/c-myc/mi R-17-92信号系统与肝癌的转移密切相关,可能成为肿瘤治疗的新靶点。