论文部分内容阅读
目的：构建人真核表达的hTAZ慢病毒载体pLenti6/V5-hTAZ，转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒，研究hTAZ对前成骨细胞MC3T3-E1分化的调控作用。方法：将已经过测序验证的，含有hTAZ基因慢病毒入门质粒pENTR221-hTAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。对重组质粒进行酶切鉴定并在细胞中验证表达。将该重组载体和慢病毒包装质粒充分混合，用阳离子脂质体Lipofactamine转染293FT细胞，培养和待细胞完全裂解后收集富含hTAZ基因的慢病毒颗粒上清液，取适量上清液感染MC3T3–E1细胞，采用杀稻瘟菌素（Blastcidin）筛选，建立了稳定过量表达hTAZ蛋白的MC3T3-E1/hTAZ细胞系。用条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ细胞成骨、成脂分化，von Kossa和茜素红染色比较MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ成骨分化程度差异；油红O染色比较其成脂分化差异，考察hTAZ基因过表达对前成骨细胞分化的影响。结果：凝胶电泳和测序结果均证明hTAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-hTAZ构建正确，并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒，并成功感染MC3T3-E1细胞。von Kossa染色和茜素红染色结果表明，MC3T3-E1/hTAZ细胞成骨分化强于未转染细胞，而其成脂分化受抑制。结论：本研究构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-hTAZ，并能在细胞中正确表达。成功包装了hTAZ病毒并获得过表达hTAZ的MC3T3－E1细胞。过表达hTAZ可促进MC3T3-E1向成骨细胞分化，抑制其成脂分化。