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肿瘤,是由于机体内部正常的组织在外界因素的诱导作用下使细胞异常分化所导致的;医学及临床医学上将恶性的肿瘤称为癌症。根据2014年WHO对全球癌症所预测的结果显示全球癌症患者的数量将会迅猛的增加;在未来的十几年里面,每年患有各类型癌症的总数极有可能突破到2200万以上,而且由于患有癌症而导致死亡的数量也会相对增加到1300万左右。随着全世界患肿瘤人数的增加,针对于抗肿瘤的治疗方法不断创新和研究迫在眉睫。p53作为一种特殊的抑癌基因得到人们广泛的关注。原因是科学家发现超过50%以上的患有肿瘤的病人体内都会存在p53基因的异常。p53基因与人类50%的肿瘤有关,其包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌等。p53在细胞的周期调控、凋亡和肿瘤的形成及恶化过程中都有十分重要的作用。因此针对p53的特殊功能并加以开发利用对于治疗肿瘤可以起到至关重要的作用。本课题主要目的是将对肿瘤细胞具有抑制作用的p53与具有肿瘤细胞靶向作用的LHRH以及具有穿梭细胞膜功能的TAT蛋白核心肽段进行基因重组,制备具有肿瘤靶向性及跨膜功能的重组蛋白LHRH-TAT-p53。为抗肿瘤治疗药物奠定础。本研究将pET28a-TAT-GFP质粒作为PCR模板,设计含有LHRH基因序列的PCR引物,经过PCR扩增出LHRH-TAT-GFP基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到原核表达载体pET28(a)中,构建重组表达质粒pET28a-LHRH-TAT-GFP,转化至感受态E.coliBL21(DE3)细胞中,测序结果正确后转化至表达菌E.coliBL21(DE3)中。采用几个常见温度进行优化诱导,确定最佳温度为30℃,以最佳温度为基础确定最佳诱导时间为4h。经12%SDS-PAGE蛋白电泳表明其中的目的蛋白主要以可溶形式表达。探索用不同层析介质纯化目的蛋白,成功获取高纯度以及高浓度蛋白。其纯化流程为:将超声处理后菌液低温离心上清液添加终浓度为1.25mol/L的硫酸铵,4℃静置后离心取上清进行Phenyl-HP疏水层析,目的蛋白经30mm/LTris溶液洗脱下来,再经过Q阴离子交换层析,最终目的蛋白在30mm/LTris,0.25mol/LNaCl溶液中,用1×PBS透析,浓缩后成功获得相对分子质量约为30kD、浓度为1.62mg/mL的LHRH-TAT-GFP重组蛋白。在荧光显微镜下进行融合蛋白的入胞能力的检测,借助绿色荧光蛋白GFP的荧光特殊性,对LHRH的介导和TAT蛋白的转导入胞能力可视化。通过荧光显微镜观察明显可见重组蛋白在细胞内的分布,说明利用LHRH的介导作用和TAT的转膜作用,可以将重组蛋白转运至细胞内。将合成的含有酶切位点的p53基因,与先前成功构建的重组质粒pET28a-LHRH-TAT-GFP双酶切后连接得到重组质粒pET28a-LHRH-TAT-p53,在经过PCR得到目的片段LHRH-TAT-GFP,对目的片段及空载体pET20b进行双酶切后用T4DNA酶进行连接,转化至感受态E.coliDH5α中,测序结果正确后在转化至E.coliBL21(DE3)细胞中,成功获取表达菌。对其诱导表达条件进行优化,确定最佳诱导温度为32℃,最佳诱导剂浓度为0.8mmol/L,诱导时间为5h经过诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,在54kD处有目的蛋白,且蛋白以包涵体形式表达。探索纯化工艺,首先利用蛋白含有组氨酸标签的特性,选择用金属螯合层析柱进行粗纯化,然后再用阴离子柱进行精纯,最终目的蛋白在6mol/LUrea,0.5mol/LNaCl溶液中,对目的蛋白进行复性,最终得到重组蛋白LHRH-TAT-p53,蛋白浓度为1.52mg/mL,用细胞实验来检测蛋白活性。向铺好细胞的96孔内加入一定浓度的蛋白,观察细胞生长变化,加入蛋白12h后发现hela细胞及BGC(胃癌细胞)细胞有明显死亡,而正常细胞MDCK(狗肾)细胞生长状态无明显变化,表明LHRH-TAT-p53蛋白对癌细胞有抑制作用。用CCK-8法检测蛋白对细胞的抑制作用,发现蛋白对这两种癌细胞的抑制率随浓度增加而增加。