【摘 要】
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肠道上皮是人体消化吸收营养物质及与肠道菌群互作的重要场所。Hans Clevers团队于2009年成功将由小鼠肠道组织分离出的单个Lgr5+干细胞培育成3D肠道上皮类器官,肠道类器官极大地增强了人们对肠道干细胞生理学的理解,使体外复杂肠道模型的产生成为可能。然而,3D肠道上皮类器官为封闭的球形结构,给后续的应用带来了极大的不便,构建真实模拟肠上皮开放界面的体外3D肠上皮单层细胞模型势在必行。构建3
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肠道上皮是人体消化吸收营养物质及与肠道菌群互作的重要场所。Hans Clevers团队于2009年成功将由小鼠肠道组织分离出的单个Lgr5+干细胞培育成3D肠道上皮类器官,肠道类器官极大地增强了人们对肠道干细胞生理学的理解,使体外复杂肠道模型的产生成为可能。然而,3D肠道上皮类器官为封闭的球形结构,给后续的应用带来了极大的不便,构建真实模拟肠上皮开放界面的体外3D肠上皮单层细胞模型势在必行。构建3D肠上皮单层细胞模型的核心是制备促进肠道细胞体外生长和分化的支架材料,以形成接近体内肠道组织功能的体外模型。本工作以明胶和纳米纤维为原料构建仿隐窝胞外基质物理化学结构（明胶基化学成分、纳米纤维网络结构和隐窝状多孔结构）的多孔支架,促进原位分离的隐窝在支架材料上的生长和分化,形成充分分化和表达的体外3D肠上皮细胞单层模型,评价致病菌和益生菌在肠道炎症中的作用,验证该模型作为体外肠道上皮免疫反应评估工具的潜能。主要结果如下:（1）通过明胶复合静电纺聚乳酸纳米纤维或氧化细菌纤维素纳米纤维构建明胶基微纳级多孔结构的支架材料,获得孔分布均匀、孔径大小适宜、孔壁覆盖仿生胞外基质中胶原蛋白纤维的纳米纤维网络的明胶（Gel）/氧化细菌纤维素纳米纤维（TOBC）复合支架。经过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）交联,Gel/TOBC复合支架水稳定性提高,弹性模量增加。（2）以美拉德反应交联取代EDC/NHS交联,支架弹性模型进一步提升。葡萄糖添加量20 wt%时支架的水稳定性最好（重量损失率＜5%）、孔隙率最高（88.30±0.79%）、弹性模量最大（99.71±5.58 KPa）。通过人结直肠癌（Caco-2）细胞培养发现,美拉德反应交联的支架无细胞毒性,有良好的细胞相容性,提高支架的弹性模量可促进Caco-2细胞的增殖。（3）与传统聚碳酸酯Transwell相比,基于美拉德反应交联的Gel/TOBC复合支架更有利于原代肠道细胞的正常生长和功能分化,高弹性模量的支架显著促进肠道细胞分化,细胞分化相关的基因表达（包括ZO-1、SI、Mucin-2、VILLIN、CHGA和Lgr5）和蛋白表达（Mucin-2、CHGA和SI）均更接近于肠道组织。（4）基于美拉德反应交联的Gel/TOBC复合支架构建的体外3D肠上皮细胞单层模型可作为体外肠道上皮免疫反应评估的工具,评估了益生菌在抑制大肠杆菌肠道致炎中的功效,发现益生菌及其上清液能明显抑制由大肠杆菌引起的原代肠道细胞分泌的TNF-α的增加,同时提高IL-10的分泌,降低细胞坏死和凋亡来保护肠道上皮细胞,缓解肠道炎症。
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