黑素皮质素4受体(melano cortin-4 recepto r, MC4R)是黑素皮质素受体(melanocortin receptors, MCRs)家族成员之一,属于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCRs)超家族成员。MC4R广泛存在于动物的中枢神经系统中,主要生理学功能是控制食欲和体重,从而维持体重稳态。cAMP/PKA信号通路是MC4R的经典信号通路,当激动剂或拮抗剂与MC4R结合后,改变细胞内cAMP的水平,进而改变蛋白激酶A (PKA)的状态,引发相应的生理学效应。目前,关于人、猪等动物MC4R及其突变体信号通路的研究已见报道,而且以人MC4R为靶点的高通量药物筛选模型已成功建立。但对鸡MC4R (cMC4R)及相关突变位点的研究只集中于基因多态性与经济性状之间关系的研究。而关于cMC4R及其突变体信号通路的研究却很少。本研究在cMC4R野生型(WT)及4个突变体真核表达质粒成功构建的基础上,利用三种MC4R激动剂(a-MSH、β-MSH、NDP-MSH)和拮抗剂(SHU9119)研究和探讨了配体对cMC4R WT及突变体cAMP/PKA信号通路的影响。并且基于cMC4R信号通路,应用报告基因法建立了以cMC4R为靶点的细胞筛选模型,为筛选出cMC4R激动剂和反向激动剂奠定了基础。主要研究结果如下：1、为了研究CMC4RWT及4个突变体(Q18H、G21R, S76L和HL299P)的基础活性,本研究将cMC4R WT及4个突变体的真核表达质粒与萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL4.29 [luc2P/CRE/Hygro]、海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK共转染HEK293T细胞,应用双报告基因法检测受体在无配体作用时荧光素酶的表达水平,间接反映cMC4RWT及4个突变体的基础活性。结果显示Q18H的基础活性极显著高于WT(P<0.01),L299P的基础活性极显著低于WT (P<0.01), G21R和S76L的基础活性与WT的相比差异不显著(P>0.05)。2、为了研究不同激动剂对cMC4R W1及4个突变体cAMP/PKA信号通路的影响,本研究将cMC4R W1及4个突变体的真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染HEK293T细胞,检测受体在激动剂(a-MSH、β-MSH. NDP-MSH)的作用下荧光素酶的表达量,反映细胞内cAMP水平。结果发现三种激动剂的内在活性为：NDP-MSH> a-MSH=β-MSH;4个突变体中cMC4R L299P的cAMP水平极显著低于cMC4R WT (P<0.01),说明该突变对cMC4R结构和功能的影响较大,使cMC4R几乎失去了与激动剂的结合能力。3、为了研究MC4R拮抗剂和激动剂共同作用对cMC4R WT cAMP/PKA信号通路的影响,本研究将cMC4R WT真核表达质粒与报告基因质粒、内参质粒共转染HEK293T细胞,检测受体在拮抗剂SHU9119和激动剂(a-MSH、β-MSH、NDP-MSH)的共同作用下荧光素酶的表达量,反映细胞内cAMP水平。结果表明,无论何种激动剂(a-MSH、β-MSH、 NDP-MSH)与MC4R WT作用,高浓度和中浓度的MC4R拮抗剂SHU9119都能够显著抑制激动剂的激动作用,低浓度的SHU9119抑制作用不明显。4、为了构建cMC4R激动剂和反向激动剂的细胞筛选模型,本研究将cMC4R WT真核表达质粒与报告基因质粒按1：5的比例共转染到CHO-K1细胞,经G418 (800μig/ml)和潮霉素B(400μg/ml)抗性筛选后,有限稀释法获得了5个稳定表达目的基因的单克隆(A2、F7、F8、F9、H10),其中单克隆A2的萤火虫荧光素酶的相对表达量最高,将其作为阳性细胞株；阳性细胞中提取总RNA,经RT-PCR在预期位置扩增出两条目的条带,一条为cMC4R基因(996bp),另一条为萤火虫荧光素酶基因(1653bp)；对细胞筛选模型进行优化,结果是当激动剂NDP-MSH终浓度为10-9mol/L, NDP-MSH孵育时间为8h,溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z’因子为0.82,说明建立的筛选方法可靠、稳定,可用于cMC4R激动剂和反向激动剂的筛选。