第一部分合并症对晚期非小细胞肺癌患者预后的影响研究背景:肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,每年约有78.1万新发病例。肺癌患者预后较差,5年生存率仅仅只有10%-12%。约有90%肺癌患者,尤其是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),与吸烟有密切关联。此外,老龄也是肺癌发生的危险因素之一。值得指出的是,高龄和吸烟还均与合并症密切相关,容易导致各种疾病,如高血压、心脏病以及糖尿病等。这也叫间接表明合并症等高危因素与肺癌发生发展密切相关。随着社会老龄化加剧,老年患者的生存期越来越长,肺癌患者同时合并其他疾病的可能性也愈发增大。已有研究认为合并症对患者生存期有一定影响。合并症可能通过以下不同方式影响着肺癌患者的预后。首先,这些合并症本身可能对患者生存有负面作用。例如,肺癌患者常合并的各种疾病,包括慢性阻塞性肺病、脑血管疾病、心力衰竭和心肌梗死等等。其次,合并症可能会掩盖肺癌的特异性表现特征,造成肺癌误诊或漏诊,甚至妨碍肺癌准确分期,影响肺癌全面诊断评估。第三,手术干预对肺癌患者的生存有积极作用,但合并症可能与手术干预可能会相互冲突矛盾,造成本该手术的患者因为合并症而暂时不能及时手术治疗。多数情况下合并症会对患者生存产生负面影响。但由于合并症的存在,这样反而会增加患者与医生之间的接触交流,使得医生能够有早期诊断肺癌的可能性,间接对患者预后产生积极影响。当前已有多种评估患者合并症的风险模型构建或正在构建。查尔森合并症指数(Charlson comorbidity index,CCI)和简化合并症评分(Simplified comorbidity score,SCS)是两种被广泛认可的评估合并症模型。这两种合并症指数既往就多次被用作评估各种癌症(包括NSCLC)患者的生存和预后。尤其是,SCS系专门针对肺癌所设计的。在本研究中,我们旨在分析针对接受抗PD1抗体免疫治疗的晚期NSCLC患者中,CCI和SCS 模型评估的合并症情况与临床结局的相关性,包括患者生存期和免疫相关不良事件(Immune-related adverse events,irAEs)发生情况。同时,我们还分析了晚期 NSCLC合并糖尿病患者的血糖控制水平对患者生存期的影响。研究对象与方法:在过去的两年里,66名在我们科室接受了抗PD1抗体(Pembrolizumab,Nivolumab和Toripalimab)免疫治疗的NSCLC患者被纳入该项回顾性研究。我们收集合并症模型指数(CCI和SCS)和临床结局等方面的数据,包括免疫治疗应答率、无疾病进展生存期(Progression-free-survival,PFS)和irAEs发生率。根据合并症评估模型将患者分为两个亚组:合并症严重组(CCI≥1或SCS≥8)和合并症轻微组(CCI<1或SCS<8)。此外,我们还收集了 191例晚期NSCLC合并糖尿病患者临床的PFS等数据。患者的两组之间的差异比较使用χ2检测或t检验方法。采用Kaplan-Meier方法绘制PFS曲线。P值小于0.05表示有显著统计学差异。研究结果:我们共纳入66例接受抗PD1抗体免疫治疗的NSCLC住院患者。入组的66例接受抗PD1抗体治疗患者的平均CCI和SCS分值分别为0.74(0-3)分和5.56(0-18)分。这两种合并症评分系统间相关性较弱(r=0.334;P=0.006)。CCI<1人群的疾病控制率明显比CCI≥1组的患者高(P<0.001),但SCS<8和SCS≥8这两组患者的疾病控制率相近(P=0.585)。CCI<1 组患者 PFS 中值为 271.0(95%CI:214.3-327.7)天,显著高于CCI≥1组的患者[232.0(95%CI:66.2-397.8)]天,两组间比较的P值等于0.0084。然而,SCS<8 组和 SCS≥8 组患者的中位PFS 分别是271.0(95%CI:138.7-403.3)天和222.0(95%CI:196.2-247.8)天,两组之间无统计学差异(P=0.2106)。合并症评估指数高低与irAEs发生率也无明显相关性(CCI:35.8%vs.23.6%,P=0.286;SCS:28.0%vs.29.3%,P=0.912)。同时,我们还分析了 191例晚期NSCLC合并糖尿病患者的生存期情况。晚期NSCLC合并糖尿病患者的PFS[252.0(95%CI:198.6-305.4)较单纯晚期 NSCLC 患者的 PFS 明显缩短[157.0(95%CI:134.0-180.0)天],P<0.0001。同时,化疗期间血糖控制良好患者的PFS显著高于血糖控制不佳的患者[197.0(95%CI:136.3-257.7)天 vs.132.0(95%CI:112.5-151.5)天,P=0.0003]。研究结论:1、在接受抗PD1抗体治疗的NSCLC患者中,CCI值较高(而非SCS)可能与预后较差有关,可以作为评估抗PD1抗体治疗效果的预测危险因素。2、血糖控制不佳是晚期NSCLC合并糖尿病患者生存期的危险因素之一。3、合并症对非小细胞肺癌患者的免疫治疗相关性不良事件的发生率无显著影响。第二部分贫血对晚期实体瘤患者抗PD1/PD-L1抗体免疫治疗的疗效影响与机制研究研究背景:合并症能够影响肿瘤患者的预后。贫血在恶性肿瘤患者中十分常见,是肿瘤患者最常见合并症之一,尤其是晚期阶段的患者。有研究对不同恶性肿瘤患者的血红蛋白水平进行检测后发现,贫血在肺癌患者中发生的比例远远高于其他癌症患者,而尤以晚期肺癌阶段且接受放化疗的患者最容易并发,临床发生率可达90%左右。由于贫血主要是减少机体的组织供氧情况,可以使得患者的各个器官系统均会出现不同程度的缺氧症状,缺氧后不仅能够直接影响患者的生活质量,还对肿瘤患者的治疗效果和生存时间有不可避免的影响。不仅如此,前期我们研究发现,晚期肿瘤合并贫血的患者或荷瘤小鼠晚期的红系分化受阻,导致CD45+EPCs(Erythrocyte progenitor cells)明显增加,大量富集在脾脏等器官,通过表达活性氧(Reactive oxygen species,ROS)发挥着免疫抑制作用。究竟贫血对肿瘤患者的预后有什么影响,尤其是对抗PD1/PD-L1(Programmed cell death 1/programmed cell death ligand 1)抗体免疫治疗效果的影响暂未见报道。本研究拟探讨免疫治疗前合并贫血对接受抗PD1/PD-L1抗体治疗的晚期实体瘤患者生存期影响,及其贫血对机体免疫细胞的数量及功能作用,并借此探讨贫血情况下骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSC)发育的新来源,为进一步解释贫血患者免疫力低下以及对肿瘤免疫治疗应答较差提供潜在的细胞理论机制。研究对象与方法:(1)贫血对晚期实体瘤患者接受抗PD1/PD-L1抗体治疗预后的影响该研究回顾性分析了在2016年1月至2019年1月期间就诊于同济大学附属上海肺科医院的晚期NSCLC患者(ⅢB或Ⅳ期),以及于2018年1月到2019年12月在陆军军医大学第二附属医院住院治疗的70名除外肺癌的其他类型恶性实体肿瘤患者。这些患者均已接受了抗PD1/PD-L1抗体单药治疗。采用Kaplan-Meier法计算并绘制PFS和总生存期(Overall survival,OS)图,log-rank检验法比较各组间的数据差异。P值小于0.05则意味着有显著统计学差异。(2)贫血对肺癌患者外周血免疫细胞数量的影响本研究采集了 2017年在我院明确诊断为非小细胞肺癌的晚期患者(Ⅲ或Ⅳ期)在接受任何抗癌治疗前的外周血细胞,并行流式细胞术检测。血红蛋白含量(hemoglobin,Hb)以110g/L为临界值,分为贫血组(<110g/L)和未贫血组(≥110g/L)。然后进行流式细胞术分析其外周血免疫细胞数量等情况。(3)贫血对荷瘤小鼠抗PD1/PD-L1抗体治疗的预后影响与机制研究我们先用苯肼成功诱导贫血小鼠模型,分别接种了 MC38肠癌和B16-F10黑色素瘤细胞株。流式细胞术检测各组小鼠脾脏免疫细胞的数量与功能。并予以抗PD-L1抗体免疫治疗,再次用流式细胞技术检测免疫治疗后肿瘤组织内的抗肿瘤免疫效应细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)数量与功能改变。(4)肿瘤晚期合并贫血时的MDSC来源新机制——CD45+EPCs转分化为MDSC首先,流式分选出CD45.1+LLC荷瘤晚期小鼠脾脏中的CD45+EPCs细胞,并尾静脉回输至辐照后的CD45.2+小鼠。于回输后第5天流式细胞术检测脾脏中MDSC占CD45.1+细胞的比例。其次,流式分选出LLC荷瘤小鼠(第0、14和28天)和MMTV-PyMT自发性乳腺癌晚期小鼠(18周龄)的脾脏CD45+EPCs细胞,并用MDSC诱导培养基于37℃度细胞培养箱中体外培养。72小时后,流式细胞术检测诱导分化的MDSC细胞比例。并将诱导分化的MDSC与CD8+T细胞混合,检测其对T细胞增殖的免疫抑制功能情况。最后,分选出肺癌合并贫血患者及其相应的对照组患者外周血和胸腔积液中不含MDSC的CD45+EPCs细胞,体外诱导分化,72小时后用细胞流式术检测MDSC样细胞比例。研究结果:(1)我们共纳入了 143例接受抗PD1/PD-L1单药治疗的晚期NSCLC患者的临床特征数据。在总缓解率方面,73.3%的重度贫血患者(Hb<90g/L)出现了疾病进展,明显高于轻中度或未贫血患者(Hb≥90g/L)的33.6%。重度贫血患者均未出现部分缓解。贫血是患者 PFS 的独立危险因素[Hazard ratio(HR)=2.92(95%CI:1.25-6.81),P<0.0001],轻中度或未贫血的患者组的中位PFS显著高于重度贫血患者(4.40个月vs.2.07个月,P<0.0001),贫血也是患者总生存期的独立危险因素[HR=3.69(95%CI:1.30-10.49),P<0.0001],轻中度或未贫血患者组的中位PFS显著高于重度贫血患者(16.83个月vs.4.67个月,P<0.0001)。此外,还分析了 70例接受抗PD1/PD-L1抗体单药治疗的除肺癌外其他晚期恶性实体瘤患者。随着贫血严重程度增加,患者的疾病控制情况逐渐下降,DCR依次为71.7%、64.3%、54.6%以及25%。重度贫血患者组的PFS要明显短于轻中度或未贫血的患者(1.02个月vs.6.83个月)。重度贫血患者相较于轻中度或未贫血患者比较的风险系数是2.89(1.05-7.99),P=0.0019。(2)我们检测了肿瘤合并贫血患者与肿瘤无贫血患者外周血中的T淋巴细胞和NK细胞(Natural killer cell,NK),发现贫血患者 CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞以及NK细胞的绝对数均显著小于未贫血患者(P<0.01);而恶性肿瘤合并贫血患者的MDSC和调节性T细胞的绝对数均显著高于未贫血患者(P<0.01)。(3)荷瘤合并贫血小鼠的脾脏中免疫细胞比例(CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞等)均显著低于未贫血的荷瘤小鼠(P<0.01)。同时,荷瘤合并贫血小鼠的脾脏CD8+T细胞中的CD107a+、IFN-γ+以及TNF-α+细胞比例均显著低于单纯荷瘤小鼠CD8+T细胞中的比例(P<0.001)。抗PD-L1抗体能显著抑制荷瘤B16-F10和MC38的未贫血小鼠肿瘤增长。而在经抗PD-L1抗体治疗的MC38和B16-F10荷瘤小鼠模型中,贫血小鼠肿瘤组织CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD107a+、IFN-γ+以及TNF-α+细胞比例较无贫血小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD107a+、IFN-γ+以及TNF-α+细胞比例显著降低(P<0.001)。(4)体内回输实验中,野生型来源的CD45+EPCs细胞未能分化成为MDSC,荷瘤早中期供体小鼠有12%的CD45+EPCs发育成MDSC;而来自荷瘤晚期供体的CD45+EPCs高达24%左右的细胞发育成MDSC。体外诱导分化实验中,在荷瘤晚期合并贫血小鼠脾脏的CD45+EPCs细胞有30%以上分化成MDSC。而且该诱导的MDSC细胞体外与CD8+T细胞继续共培养,能够显著抑制CD8+T细胞的增殖情况(P<0.0001)。合并贫血的自发性乳腺癌晚期小鼠的脾脏CD45+EPCs中,有将近30%的细胞可分化成MDSC,且能够显著抑制CD8+T细胞的增殖(P<0.0001)。从慢性肾衰贫血患者和晚期肿瘤合并贫血患者的外周血分选出除外MDSC的CD45+EPCs进行体外诱导培养。结果发现,慢性肾衰贫血患者的CD45+EPCs在体外诱导后未能形成MDSC样细胞,而癌症晚期患者合并贫血中有大约10%的CD45+EPCs最终分化成典型的MDSC样细胞表型,两组之间具有显著统计学差异(P<0.0001)。此外,在相同的诱导条件下,从结核性胸腔积液中收集的CD45+EPCs未能分化MDSC样细胞,而来自恶性胸腔积液中的CD45+EPCs有60%以上的细胞可以表达MDSC表面标志物。研究结论:(1)晚期恶性实体瘤合并贫血患者的抗PD1/PD-L1抗体治疗的免疫应答率显著下降,患者生存期明显缩短。合并贫血是导致肿瘤患者免疫治疗预后不良的因素之一。在临床中应注意对晚期恶性实体瘤患者贫血的预防及纠正,从而提高抗PD1/PD-L1抗体免疫治疗的效果,改善患者的临床预后。(2)晚期肺癌合并贫血患者的免疫功能较未贫血者显著降低。(3)贫血能够降低荷瘤小鼠的免疫力。(4)抗PD1/PD-L1抗体能够显著抑制MC38和B16-F10荷瘤小鼠的肿瘤体积,达到抗肿瘤效果。(5)荷瘤小鼠合并贫血的抗PD1/PD-L1抗体免疫治疗效果较差,可能存在的机制是贫血导致了机体的抗肿瘤免疫效应细胞数量与功能下降。(6)肿瘤晚期合并贫血机体中的CD45+EPCs细胞可能是MDSC来源的新机制,并加剧了晚期肿瘤患者的免疫抑制状态,导致抗PD1/PD-L1抗体免疫治疗效果不佳。