RORγt及SOCS1/3在哮喘小鼠肺组织中的表达及意义

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研究背景呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是一种属副粘液病毒科RNA病毒,至今已知的该病毒有2个主要血清型和9个亚型,共编码包括吸附性G蛋白、融合性F蛋白、小疏水性SH蛋白、非机构蛋白NS1和NS2在内的11种蛋白质。RSV病毒多见于新生儿和6个月以内的婴儿,是婴幼儿呼吸道感染最为常见的病原体,尤其是2-6个月的小婴儿感染RSV病毒后会发生严重的毛细支气管炎,并有发展为支气管哮喘的趋势,是诱发儿童哮喘的重要危险因素。目前有关哮喘和RSV诱发哮喘急性发作的机制尚不完全明确,很多学者从Th1/Th2变化和Th17/Treg失衡两方面进行了大量且深入的研究,而其中转录因子维甲酸孤儿核受体γt(retinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)和细胞因子信号传导抑制因子1/3(suppressor of cytokine signaling1/3,SOCS1/3)受到较多的关注。RORγt是维甲酸孤儿核受体家族(retinoic-related orphan receptor subfamily,ROR)中的成员RORγ在免疫细胞上特异性表达的亚型,是一种调控人和鼠辅助性T细胞17(T helper cell,Th17)的关键性的转录因子,具有调节Th17细胞分化以及调节Th17细胞分泌和表达具有特异性效应的白介素17(interleukin 17,IL-17)的作用。Th17细胞的主要效应因子就是IL-17,两者与很多自身免疫性疾病和炎症的发生及发展密切相关,其中与RSV感染后哮喘的关系已经得到初步证实。Th17细胞表达分泌的IL-17是一种具有强大招募中性粒细胞的前炎性细胞因子,具有促进多种细胞分泌释放炎性因子的作用,导致气道中分泌有大量黏液,同时使其呈现高反应性状态,从而引起气道重塑,引发哮喘。细胞因子信号抑制物(suppressor of cytokine signaling,SOCS)蛋白家族的成员也被证实和很多超敏反应、自身免疫性疾病和炎症疾病的发生和发展有关,而SOCS1和SOCS3作为其中的重要分子,已经有研究指出二者与IL-6、IL-10、IL-12、IFN、LPS等多种炎症因子和抗炎因子的表达水平产生影响,同时还能抑制多种免疫分子的信号传导。SOCS1能够与Janus Kinases(JAKs)中的JAK1、JAK2HE和JAK3结合,抑制其活性,而JAks/信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路又是重要的激活在宿主天然抗病毒反应中,具有重要作用的干扰素功能的细胞因子信号通路,是介导干扰素的抗病毒和免疫调节作用的关键因素。SOCS3则能与特异性细胞因子受体相结合,抑制JAK/STAT信号通路。而RSV病毒则会通过影响SOCS1/3蛋白的表达水平对干扰素介导的抗病毒反应产生抑制作用,二者也被认为是干扰素抗RSV感染并诱发哮喘急性加重中的重要因子。因此为了明确RORγt及SOCS1/3表达对RSV感染在哮喘急性加重发生的影响,本文则利用OVA诱发哮喘的BALB/c小鼠,对其进行反复的RSV感染,以观察实验小鼠气道炎症以及哮喘的发生情况,初步探讨二者在病毒感染影响下哮喘气道炎症的机制。目的探讨转录因子维甲酸孤儿核受体γt(retinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)及细胞因子信号抑制因子1/3(suppressor of cytokine signaling1/3,SOCS1/3)在呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小鼠肺组织中的表达水平和意义,以进一步探讨RSV感染引起的哮喘的发病机制。方法选择6-8周龄的雄性BALB/c小鼠(SPF级)36只,作为研究对象,将其随机分为空白组、OVA致敏组(哮喘组)和OVA/RSV(哮喘合并RSV感染)组3组,每组12只,建立哮喘模型。其中OVA/RSV组应用OVA致敏,隔天应用RSV鼻腔滴入,建立并复制急性RSV病毒感染哮喘模型;OVA致敏组则采用相同的方法进行OVA致敏与激发;空白组则应用相等剂量的PBS溶液代替OVA和RSV。观察3组小鼠的一般情况,应用小鼠动物呼吸机检测各组小鼠的气道阻力;收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),采用血细胞分析仪对其中的炎症细胞进行分类和计数;取各组小鼠的肺组织进行固定、脱水、包埋、切片后,常规苏木素-伊红(HE)染色,观察各组小鼠肺组织病理学变化;采用实时荧光定量PCR法和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法,分别检测3组小鼠肺组织中的RORγtmRNA及SOCS1,SOCS3mRNA表达水平。结果(1)空白组小鼠皮毛始终光亮,反应灵敏,呼吸正常;OVA致敏组和OVA/RSV组小鼠每次激发后会聚集在玻璃器皿的角落,行为表现由前期躁动不安转变为后期的迟钝。(2)OVA致敏组和OVA/RSV组小鼠的气道阻力(RL)均明显高于空白组,肺顺应性(Cdyn)则明显低于空白组(P<0.05),且OVA/RSV组小鼠的RL明显高于OVA致敏组,Cdyn明显低于OVA致敏组(P<0.05)。(3)OVA致敏组和OVA/RSV组小鼠BALF中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞所占比例均明显高于空白组小鼠,单核细胞所占比例则明显低于空白组(P<0.05),且OVA/RSV组小鼠BALF中三者所占比例与OVA致敏组相比亦具有明显差异(P<0.05)。3组小鼠的淋巴细胞和中性粒细胞所占比例两两比较无明显差异(P>0.05)。(4)空白组小鼠肺组织无明显炎症反应,血管和气管均未见扩张和炎症细胞浸润,肺泡壁光滑,肺泡腔中无渗出物,气道周围无胶原增生,气道也无黏液分泌物;OVA致敏组小鼠气道周围可见有胶原增生,气道中有黏液分泌物,肺间质和肺泡中有杯状细胞增生,可见嗜酸性粒细胞,支气管及伴行血管周围浸润有大量炎症细胞,支气管黏膜增厚;OVA/RSV组小鼠则可见气道周围明显的胶原增生,有明显的粘液分泌物,肺泡中有明显的炎性细胞浸润,狭小明显,毛细血管充血扩张,小鼠表现出典型间质性肺炎。(5)OVA致敏组与OVA/RSV组小鼠肺组织中RORγtmRNA表达水平明显高于空白组(P<0.05),且OVA/RSV组小鼠肺组织中RORγtmRNA表达水平及RORγt蛋白表达也明显高于OVA致敏组(P<0.05)。(6)OVA致敏组与OVA/RSV组小鼠肺组织中SOCS1和SOCS3mRNA表达水平明显高于空白组(P<0.05),且OVA/RSV组小鼠肺组织中SOCS1和SOCS3mRNA表达水平也明显高于OVA致敏组(P<0.05)。结论哮喘小鼠及合并RSV感染的哮喘小鼠肺组织中可见RORγt及SOCS1/3mRNA表达水平增强,进而导致小鼠肺组织炎症反应增强,这可能是哮喘发生的机制之一。
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