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第一部分WFDC1基因克隆及pcDNA3.1(+)-WFDC1真核表达载体的构建目的克隆表达WFDC1基因并分析基因特征和预测蛋白结构及功能,构建pcDNA3.1(+)-WFDC1真核表达载体。方法从人正常前列腺组织中提取mRNA,设计特异性引物,应用RT-PCR的方法扩增WFDC1基因中包括全长CDS编码区的基因片段,将PCR产物纯化后连接至克隆载体pGEM-T-Easy,经蓝白筛选后挑取阳性克隆,凝胶电泳鉴定后送测序。将测序正确的WFDC1基因片断用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切后定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切验证重组真核表达载体。经大量扩增后的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-WFDC1供后续脂质体转染HepG2细胞使用。结果成功从正常人前列腺组织中克隆出684bp的人WFDC1基因的CDS编码区的全长序列,通过测序与Genebank登记序列同源性为100%,确认为目的基因。并成功构建了pcDNA3.1(+)-WFDC1重组真核表达载体,经酶切鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1(+)真核表达载体中。结论本研究成功克隆了人的WFDC1基因,经分析发现WFDC1基因编码220个氨基酸,分子量为2.4Kda,其中包括23个酸性氨基酸,30个碱性氨基酸,48个极性氨基酸和65个疏水氨基酸。并构建了pcDNA3.1(+)-WFDC1真核表达载体,为下一步进行肿瘤细胞的转染打下基础。第二部分WFDC1基因在HepG2肝癌细胞的稳定表达及其抑制细胞集落形成实验研究目的研究转染WFDC1基因在体内外HepG2肝癌细胞中的稳定表达及其转染WFDC1基因对肝癌细胞株的生长抑制作用。方法研究1(集落形成实验)将转染重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-WFDC1的HepG2细胞设为实验组,将转染空载体pcDNA3.1(+)转染HepG2细胞设为对照组,每组共7例,采用脂质体转染法,转染后利用倒置相差显微镜观察转染后细胞形态的变化,并于转染后48h采用RT-PCR方法验证转染效果。G418筛选后比较两组形成的集落数目。研究2(动物实验)：将18只雌性,6周龄,均重20g的BLBA／c裸鼠随机分为3组,在裸鼠右腋皮下接种细胞2×106个／只。实验组接种转染pcDNA3.1(+)-WFDC1的HepG2细胞,对照组接种转染pcDNA3.1(+)的HepG2细胞,空白组接种HepG2细胞。饲养4周后取瘤,RT-PCR法验证基因表达情况。结果(1)实验组7例中集落数目最多为46个,最少为21个,平均数为(34.4±8.8)个；对照组7例中集落数目最多为60个,最少为35个,平均数为(45.7±8.2)个,两组集落数比较,差异具有统计学意义(p<0.05),表明WFDC1基因可抑制HepG2细胞集落的形成。(2)18只裸鼠全部成瘤,经RT-PCR法验证实验组全部表达WFDC1基因,对照组及空白组均不表达WFDC1基因。结论转染后WFDC1基因可在HepG2肝癌细胞及肝癌细胞的成瘤组织中均稳定表达,转染WFDC1基因可抑制HepG2细胞的生长及其细胞集落形成。研究结果为下一步开展肝癌的WFDC1基因治疗研究打下基础。