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类胡萝卜素加氧酶(Carotene Oxygenase)是一种氧化酶,能够氧化裂解类胡萝卜素产生维生素A(Vitamin A,VA)类物质。在动物体中,类胡萝卜素的氧化裂解产物在视觉形成、细胞分化、免疫、基因表达调控、胚胎和生殖发育等过程中都有着十分重要的作用。在缺失该酶的果蝇(Drosophila melanogaster)视觉突变体nina B中,维生素A和视网膜色素的含量比正常果蝇明显减少,导致视觉丧失。而家蚕类胡萝卜素加氧酶还未见研究报道。本研究鉴定了家蚕类胡萝卜素加氧酶基因(Bmnina B),并通过RT-PCR、Real time PCR、Western blot及RNAi等技术对家蚕中该基因的表达模式及功能进行了研究。主要结果如下:1.家蚕BmninaB基因的克隆及鉴定根据已报道的果蝇和大蜡螟(Galleria mellonella)ninaB同源基因的序列信息,在家蚕基因组数据库中确定位于第12号染色体nscaf2825上的BGIBMGA005193为其同源基因,但通过EST分析及克隆测序验证,发现该基因在家蚕基因组中起始位置注释有误,缺失了包括5’UTR在内的两个外显子。最终确定家蚕Bmnina B基因有两种m RNA剪切型:其中第一种剪切型Bmnina B-1由14个外显子13个内含子组成,全长m RNA为2153bp,其中编码区1536bp,共编码511个氨基酸;第二种剪切型Bmnina B-2编码区1422bp,缺失了496~606位共111个碱基,引起表达蛋白第34位氨基酸由T突变为N,并缺失35到71位共37个氨基酸残基。2.家蚕BmninaB基因的时空表达模式检测根据家蚕BmninaB基因的全长序列设计引物,通过RT-PCR及Real time PCR检测家蚕Bmnina B基因在不同发育时期及五龄幼虫各组织间的表达模式。结果发现家蚕Bmnina B基因在未受精和受精后1天的卵中有高量表达,随后表达水平较低;在幼虫期一直低水平表达;在蛹蛾期家蚕Bmnina B基因的表达存在雌雄差异,在雌性个体中的表达量显著高于雄性。五龄3天不同组织的表达模式检测结果显示,家蚕BmninaB基因在头和生殖腺高量表达,在其余检测的8个组织中都只有少量表达。3.家蚕BmninaB的原核表达、纯化及多克隆抗体制备将家蚕Bmnina B全长CDS连入p ET-28a载体进行原核表达,结果发现只有少量蛋白以可溶形式存在,大部分以包涵体的形式存在。将纯化的包涵体作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。末次免疫后抗血清经ELISA检测效价超过1:12800,经过Western blot检测特异性较好。进一步检测各组织表达模式发现该蛋白在头、卵巢、神经中表达量较高,在脂肪体和中肠中也有表达。4.利用RNAi技术研究Bmnina B基因的功能体外转录合成用于干涉BmninaB基因的dsRNA,分别在上蔟后4天和6天注射雌蛹。在蛾期进行解剖观察和统计分析。结果显示,上蔟6天注射的三个梯度(80μg、150μg、220μg)中实验组同对照相比均没有显著差异,而上蔟4天的两个注射梯度(150μg、250μg)中实验组与对照组相比雌蛹造卵数显著减少,同时干涉组未受精卵和死卵的数目增加。进一步的分子水平检测证实了干涉组Bmnina B在m RNA水平和蛋白水平的表达都显著下调。