研究背景：奈比洛尔是一个高度选择性β1受体阻断剂,具有独特的舒血管作用。前期研究表明,奈比洛尔的舒血管作用具有一氧化氮(NO)依赖性,但其具体信号转导途径并不清楚。PI3K/Akt/eNOS是细胞内重要的信号转导通路。Akt可磷酸化内皮型一氧化氮合酶(eNOS),促进NO释放。同时,血管内皮NO的释放还受不同亚型K+通道的调节。PI3K/Akt/eNOS信号传导通路或K+通道是否参与奈比洛尔的舒血管作用还不得而知。另外,实验显示,奈比洛尔促进内皮NO释放可能有血管差异。目的：本研究拟通过离体血管张力实验,观察奈比洛尔对Wistar大鼠不同血管(主动脉、颈动脉、肾动脉、肠系膜动脉和股动脉)舒张作用的差异；观察NOS抑制剂,不同亚型K+通道阻断剂和PI3K/Akt阻断剂对奈比洛尔舒张作用的影响,进一步探讨奈比洛尔舒血管的机制。方法：成年雄性Wistar大鼠,220-250g,击头致昏,立即取主动脉、颈动脉、肾、肠系膜和股动脉,置于O2饱和的4℃生理盐溶液(physiological salt solution, PSS)中。主动脉和颈动脉剔除脂肪及周围结缔组织后,剪成3-4mm的血管环。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔,水平横向悬挂在浴管内,下方固定,上方以一细钢丝连于张力换能器(PowerLab),经PowerLab计算机生物信号采集分析系统记录血管的舒缩变化。浴管内含有通以100%O2、37℃的PSS 10ml。为了使标本处于长度-张力曲线的最适点开始收缩,主动脉和颈动脉环悬挂在浴管后,立即分别给予2.0g和1.0g的前负荷,温育2h。在温育期间不断调整张力,使之维持稳定,每20min更换一次新鲜的PSS。所有动脉环用60 mmol/L KCl多次刺激,当标本对刺激稳定时,即相邻连续两次同样的刺激所引起的收缩幅度差别<10%；且在此基础上10-5mol／L乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)所引起的舒张幅度≥30%时,认为血管环组织结构完整,功能正常,开始正式实验,观察药物干预的作用。用大头针固定肠系膜动脉,肾动脉和股动脉主干和周围组织,去除动脉周围的脂肪组织,选取动脉的三级分支血管,剪取2mm左右的血管环。将两根直径为40μm的钨丝穿入管腔,固定血管环在Multi Myograph System-610M浴槽内传感器上。浴槽内含有5ml PSS,持续通以100%O2,温度控制在37℃。为了使血管环处于最佳反应状态,调整肠系膜动脉、肾动脉和股动脉的跨壁压,使其分别保持在相当于100mmHg、80mmHg和100mmHg的基础压力状态,平衡60min,每20min更换新鲜的37℃PSS液。血管环的张力变化通过DMT换能系统采集,并用Chart 5.3生物信号分析处理软件记录。为了检测血管环在离体状态下对血管活性物质的反应性,在开始正式实验之前,用60 mmol/L KC1预收缩血管。当收缩达稳定的平台时,用Ach(10-5mol/L)舒张,连续二次。当相邻两次刺激的收缩幅度差别不大于10%时；在此基础上当Ach所引起的舒张幅度≥20%,认为血管环组织结构完整,功能正常,开始正式实验。用60 mmol/L KCl或苯肾上腺素(phenylephrine, Phe)(主动脉和颈动脉用10-6mol／L,肾动脉、肠系膜动脉和股动脉用10-5mol／L)预收缩不同动脉。收缩达平台后,累计加入奈比洛尔(10-7-10-5 mol／L),观察其舒张作用,建立奈比洛尔的累积对数浓度—反应曲线(Logarithm Cumulative Concentration Response Curve, LCCR)。PSS液冲洗3次,使血管张力达原来基线水平。稳定60min后,再次用60 mmol/L KC1或Phe收缩动脉。收缩达平台后,分别在浴管中加入不同亚型的K+通道阻断剂iberiotoxin (100nmol/L)、格列本脲(glibenclamide,0.1 mmol/L)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine,1 mmol/L)和氯化钡(BaCl2, lmmol/L); PI3K阻断剂Wortmannin (5×10-7 mol/L); Akt阻断剂(lL-6-hydroxymethyl-chiro-inositol 2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate,10-5 mol/L);NOS阻断剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,100μmol/L)。当血管活动再次达到平台后,在浴管中累计加入奈比洛尔(10-7-10-5mol／L)。以60 mmol/L KC1或Phe引起的张力升高为100%,评价NOS阻断剂,K+通道阻断剂和PI3K/Akt阻断剂对奈比洛尔的舒血管效应的影响。结果：奈比洛尔可浓度依赖性地舒张Phe或KCl收缩的大鼠不同动脉,其最大舒张效应(Emax)因收缩剂不同而有差异。Phe收缩血管时,奈比洛尔Emax顺序为：肠系膜动脉(96.7±12.8%)≈主动脉(94.2±5.4%)>股动脉(84.84±12.1%)≈肾动脉(80.3±3.4%)>颈动脉(74.9±10.1%)。KCl收缩血管时,奈比洛尔对肠系膜动脉的舒张作用最大(90.5±15.2%),其余动脉Emax无显著性差异：股动脉(75.7±17.7%),主动脉(73.1±11.3%),肾动脉(71.6±6.2%),颈动脉(70.9±7.1%)。奈比洛尔对不同动脉的舒张作用均可以被eNOS抑制剂L-NAME (100μmol/L)抑制,但不受P13K抑制剂wortmannin (5×10-7 mol/L)和选择性Akt抑制剂(lL-6-hydroxymethyl-chiro-inositol 2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecylcarbonate,10-5 mol/L)的影响。同样,K+通道阻断剂：iberiotoxin (100 nmol/L),格列本脲(0.1 mmol/L),4-氨基吡啶(1mmol/L), BaCl2 (1 mmol/L)对奈比洛尔的舒血管作用也无显著性影响。结论：奈比洛尔可浓度依赖性地舒张Phe或KCl收缩的大鼠不同动脉。无论是K+通道还是PI3K/Akt/eNOS信号通路均不参与奈比洛尔对大鼠主动脉、颈动脉、肾动脉、肠系膜动脉和股动脉的舒张作用。研究背景：高血压是严重威胁人类健康和生命的疾病。实验证实,高血压患者和高血压动物模型存在血管内皮功能减退,后者又加速了高血压靶器官的损害。血管内皮功能是“内皮-高血压-心血管事件”链的始动因子和载体。血管内皮功能不全可表现为血管舒缩失衡,血管内皮细胞分泌的活性物质改变,内皮结构损伤,血管重构等方面。逆转高血压内皮功能不全已经成为降压之外的另一治疗靶点。β受体阻断剂在高血压治疗中有广泛的应用。奈比洛尔是高度选择性β1受体阻滞剂,既有β1受体阻滞作用,又能增加一氧化氮(NO)生物利用度,扩张血管,没有一般β受体阻断剂代谢方面的缺点,是当前较佳β受体阻断剂。奈比洛尔可改善自发性高血压大鼠(SHR)主动脉的血管反应性,增加其血浆中NO的含量。但是,有关奈比洛尔对SHR血管重构、内皮损伤、血管中活性物质水平、小动脉血管反应性等影响的研究比较少。目的：本研究拟通过观察奈比洛尔对SHR主动脉和肾小叶间动脉重构、血管内皮损伤、血管活性物质水平及不同动脉血管反应性的影响,进一步探讨奈比洛尔对SHR血管内皮的保护作用。方法：SHR和同源正常血压大鼠Wister-Kyoto(WKY),随机分成4组：(1)SHR+Nebivolol组(n=6)：奈比洛尔(8mg/kg/day, i.g.); (2) SHR+Atenolol组(n=6)：阿替洛尔(80mg/kg/day, i.g.); (3) SHR空白对照组(n=6)；(4)WKY空白对照组(n=6)。给药过程中,每周在同一时间测量各组大鼠的体重及尾动脉收缩压。给药8周后,用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg, i.p.)麻醉大鼠。腹主动脉采血后,迅速取主动脉、颈动脉、肾、肠系膜动脉和股动脉。肾脏及一部分主动脉用4%多聚甲醛固定,用于HE染色,进行形态学观察和血管内径(luminal radius, L),中膜厚度(media thicknes, M),中膜／内径(M／L)的测量；一部分主动脉切片经免疫组织化学染色分析,观察主动脉内皮细胞八因子相关抗原(FⅧ)表达。一部分主动脉制成10%组织匀浆,与血浆离心后,测定主动脉和血浆NO(硝酸还原酶法),血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和内皮素(ET-1)(放射免疫法)和血浆vWF(ELISA)水平。另一部分主动脉和其他动脉(颈动脉、肾动脉、肠系膜动脉、股动脉)用于离体血管张力实验,观察SHR不同动脉对Phe、KCl、ET-1、AngⅡ的收缩反应及对Ach和硝普钠(SNP)的舒张反应性。结果：(1)实验期间,SHR体重及收缩压均明显高于同龄WKY。奈比洛尔和阿替洛尔对SHR大鼠体重无影响。与阿替洛尔比较,奈比洛尔可明显降低SHR收缩压,此降压作用在给药后4周最显著。(2)主动脉形态学观察结果：各组大鼠主动脉L无显著性差异,但SHR主动脉M,M／L较WKY显著增高。奈比洛尔可降低SHR主动脉M和M／L,但阿替洛尔对此无影响。(3)肾小叶间动脉形态学观察结果：与WKY比较,SHR肾小叶间动脉L减小,M与M／L增高。奈比洛尔治疗后,SHR肾小叶间动脉L增加,M和M／L显著降低,但阿替洛尔对此无影响。(4)主动脉内皮FⅧ免疫组织化学：SHR主动脉FⅧ阳性表达较WKY弱,棕色内皮层不完整。奈比洛尔给药后,SHR主动脉内皮细胞FⅧ阳性表达增强,棕色层显色较清晰,内皮完整。阿替洛尔给药后对SHR主动脉FⅧ表达无影响。(5)血浆vWF含量：与WKY组比较,SHRⅧ浆vWF水平显著升高。奈比洛尔可降低SHR血浆vWF,而阿替洛尔对SHR血浆vWF水平无显著性影响。(6)血浆及主动脉NO、ET-1、NO/ET-1:与WKY比较,SHR血浆和主动脉NO含量降低；主动脉ET-1含量增加,但是血浆ET-1水平在两组间无明显改变。而且,SHR主动脉和血浆NO/ET-1较WKY显著降低。奈比洛尔可增加SHR血浆及主动脉NO含量和NO／ET-1,但对血浆和主动脉ET-1含量无影响。阿替洛尔对SHR血浆及主动脉NO、ET-1、NO/ET-1无显著影响。(7)血浆及主动脉AngⅡ、NO/AngⅡ:SHR血浆和主动脉AngⅡ水平较WKY显著增加,NO/AngⅡ降低。奈比洛尔对血浆AngⅡ含量无影响,但可降低主动脉AngⅡ含量,使血浆和主动脉NO/AngⅡ增加。阿替洛尔对血浆及主动脉AngⅡ、NO/AngⅡ无显著影响。(8)不同动脉血管反应性：SHR主动脉、颈动脉、肾动脉、肠系膜动脉和股动脉对Phe(10-8-10-5mol／L)、KCl(20-120m mol/L);颈动脉对ET-1 (10-11-10-8mol/L)、AngⅡ(10-9-10-5mol/L)及主动脉对AngⅡ的收缩反应显著高于WKY；不同动脉对Ach (10-10-10-5 mol/L)的舒张效应则弱于WKY,而对SNP (10-10-10-4 mol/L)的舒张反应在两组无显著性差异。奈比洛尔可以降低SHR不同动脉对四种收缩剂的反应,其程度因血管不同而异：对KCl收缩的抑制作用在颈动脉和股动脉尤为明显；对Phe的抑制在主动脉、肾动脉、股动脉显著；对ET-1和AngⅡ的抑制在主动脉显著。同时,奈比洛尔可增强SHR不同动脉对Ach的舒张反应,尤其在肾动脉；但是奈比洛尔对不同动脉SNP的舒张无影响。阿替洛尔对SHR不同动脉对四种收缩剂收缩反应的抑制作用有血管差异。阿替洛尔可抑制除肾动脉和肠系膜动脉外其余动脉对KCl的收缩；抑制除肠系膜动脉外其余动脉对Phe的收缩；减少主动脉和颈动脉对ET-1, AngⅡ的收缩。阿替洛尔可增强SHR肾动脉对Ach的舒张,对SNP的舒张无影响。结论：奈比洛尔在显著降压的同时,可改善SHR血管重构,减少主动脉内皮损伤,增加SHR血浆和主动脉舒血管物质水平,降低缩血管物质含量,改善不同动脉的血管反应性,重建血管舒缩平衡。研究背景：血管内皮功能不全在心血管疾病的发生发展中起重要作用,有效预防内皮功能受损可延缓乃至逆转相关病变进程。一氧化氮(nitric oxide, NO)在内皮功能调节中发挥重要作用,被认为是维持血管结构和功能的主要因子。内源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)竞争性抑制NOS活性,减少NO生成。大量资料显示,ADMA水平的增高与多种病理状况下血管内皮功能不全有显著的相关性,可作为一个新的内皮功能不全预测因子。通过降低ADMA从而改善血管内皮功能为心血管疾病防治提供了新途径。我们第二部分的研究显示,奈比洛尔可以保护SHR血管内皮功能。但有关奈比洛尔血管内皮保护作用与ADMA系统关系的研究较少。研究目的：本实验拟从组织和细胞水平探讨奈比洛尔对内皮细胞的保护作用与ADMA系统的关系。研究方法：1、奈比洛尔对SHR ADMA系统的影响。SHR大鼠及WKY大鼠随机分成4组：(1)SHR+Nebivolol组(n=6)：给予奈比洛尔8 mg/kg/day; (2) SHR+Atenolol组(n=6)：给予阿替洛尔80mg/kg/day; (3) SHR空白对照组(n=6)；(4)WKY空白对照组(n=6)。奈比洛尔,阿替洛尔溶于蒸馏水中灌胃,对照组给予等体积蒸馏水灌胃。给药8周后,3%戊巴比妥钠(30mg/kg, i.p.)麻醉大鼠,腹主动脉取血后,迅速分离主动脉,肠系膜动脉,将其置于液氮中冷冻后-70℃保存。离心分离血浆,测ADMA (ELISA法)和NO(硝酸还原酶法)含量,NOS活性(化学法)。提取主动脉和肠系膜动脉总RNA,用RT-PCR分析eNOS,DDAH-2和PRMT-1 mRNA表达。提取主动脉和肠系膜动脉总蛋白,用Western bloting分析DDAH-2和PRMT-1蛋白表达。采用冰冻切片荧光染色行主动脉原位活性氧(ROS)检测。2、奈比洛尔对AngⅡ诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响。用AngⅡ1μmol/L培养HUVECs 24h,不加或加入阿替洛尔20μmol／L、奈比洛尔(5、10、20μmol/L)预处理1h。0.25%胰酶消化细胞,获取细胞悬液,离心收集细胞上清液,测ADMA (ELISA)和NO水平(硝酸还原酶法)水平,NOS活性(化学法)。提取HUVECs,总RNA,用RT-PCR分析eNOS, DDAH-2和PRMT-1 mRNA表达。提取HUVECs,总蛋白,用Western bloting分析DDAH-2和PRMT-1蛋白表达,同时检测细胞内DDAH活性。3、奈比洛尔对ADMA损伤HUVECs的拮抗作用。用ADMA 16μmol/L培养HUVECs 24h,不加或加入阿替洛尔20μmol／L、奈比洛尔(5、10、20μmol/L)预处理1h。0.25%胰酶消化细胞,获取细胞悬液,离心收集细胞上清液,测NO水平(硝酸还原酶法)水平、NOS活性(化学法)。提取HUVECs,总RNA,用RT-PCR分析eNOS mRNA表达,同时测细胞ROS水平。4、ADMA对离体大鼠主动脉血管反应性的影响及奈比洛尔对此的影响。成年雄性Wistar大鼠,击头致昏,快速分离主动脉。主动脉剔除脂肪及周围结缔组织后,剪成3-4mm的血管环,悬挂在浴管内,经PowerLab计算机生物信号采集分析系统记录血管的舒缩变化。观察ADMA (10-7-10-4 mol/L)对大鼠主动脉静息张力、Phe(10-6mol／L)预收缩主动脉张力、Ach(10-10-10-5mol／L)舒血管作用的影响及奈比洛尔(10-7,10-6和10-5mol／L)对此的影响。结果：1、与WKY比较,SHR血浆ADMA水平显著升高,NO水平和NOS活性明显下降。SHR主动脉和肠系膜动脉eNOS及DDAH-2 mRNA表达下降,PRMT-1 mRNA表达增加；DDAH-2蛋白表达下降,PRMT-1蛋白表达增加；主动脉原位ROS荧光强度增强。奈比洛尔可降低SHR血浆ADMA水平,增加NO含量和NOS活性,上调SHR主动脉和肠系膜动脉eNOS mRNA及DDAH-2 mRNA/蛋白表达,下调PRMT-1 mRNA/蛋白表达,降低SHR主动脉原位ROS荧光强度。阿替洛尔对SHR上述改变无影响。2、AngⅡ1μmol/L培养HUVECs 24h可明显增加上清液ADMA水平,降低NO水平和NOS、DDAH活性,下调eNOS mRNA及DDAH-2 mRNA/蛋白表达,上调RMT-1 mRNA/蛋白表达。奈比洛尔(5、10、20μmol／L)可剂量依赖性抑制AngⅡ1μmol/L所致的上述改变。预先给予阿替洛尔20μmol／L则没有起到类似的作用。3、ADMA 16μmol/L培养HUVECs 24h后,明显增加上清液ADMA水平,降低NO含量和NOS活性,升高细胞内ROS水平,下调eNOS mRNA表达。奈比洛尔(5、10、20、μmol/L)可剂量依赖性抑制ADMA 16μmol/L所致的上述效应。预先给予阿替洛尔20μmol/L则没有起到类似的作用。4、离体血管张力实验表明,ADMA (10-7-10-4 mol/L)对离体大鼠主动脉静息张力无影响,但可剂量依赖性升高Phe(10-6 mol/L)预收缩大鼠主动脉的张力,抑制Ach(10-10-10-5mol／L)的舒张反应。奈比洛尔(10-7,10-6,10-5mol／L)可剂量依赖性抑制ADMA对Phe预收缩大鼠主动脉张力的升高,减少ADMA 10-5 mol/L对大鼠主动脉Ach舒张反应的抑制。结论：奈比洛尔可通过下调PRMT-1表达,增加DDAH活性和表达,降低ADMA水平,保护内皮细胞。同时,奈比洛尔可拮抗ADMA导致的细胞损伤和血管收缩。