研究背景和目的恶性肿瘤是导致人类死亡的主要病因之一。妇科的宫颈癌是严重威胁妇女健康的主要疾病之一,在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率位列第二位,死亡率位列第五位；卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位,死亡率居首位。放疗作为恶性肿瘤传统有效的治疗手段,被广泛应用于临床。放疗是宫颈癌治疗普遍运用的手段,世界范围内70%以上的宫颈癌患者的治疗措施中包括放射治疗。腹腔外照射和腔内后装治疗是标准的治疗方法。早期宫颈癌治疗效果显著,但是晚期患者中Ⅲ期病人的5年生存期低于50%,Ⅳ期病人甚至不足20%。早期卵巢癌不容易被发现,70%的卵巢癌患者就诊时已届晚期,只有约20%的患者能早期诊断且能得到相对有效的治疗。虽然放疗不是治疗卵巢癌的首选方案,但最近几年临床治疗中逐渐采用联合放化疗的方案治疗中晚期卵巢癌患者。可见放射治疗对于肿瘤的治疗非常重要,因此研究新的放疗方案,改善放疗方法对晚期肿瘤病人的治疗意义极大。放疗过程中增强对肿瘤细胞的放射毒性,同时减少对正常细胞损伤,即研发应用肿瘤靶向放疗增敏剂是提高放疗疗效的策略之一。纳米科学技术的发展为研究新的放疗策略提供了大量的物质支持。利用纳米载体粒径小且容易调节的特性与肿瘤组织具有的高渗透性和滞留效应(EPR)以及代谢旺盛等病理生理特点,可利用纳米载体实现其对肿瘤的被动靶向和主动靶向目的,增强放疗的同时,降低毒副作用,有望在肿瘤的靶向性放疗领域实现突破。金纳米颗粒因其具备独特的生物相容性和理化特性,被多数学者选择用于肿瘤的放射治疗和影像学诊断研究,且已有研究结果支持其有较大的研究意义和应用前景。本研究在课题组的前期研究基础之上,旨在研发一种新型的复合纳米颗粒,通过体内外实验研究探讨其肿瘤靶向能力的强弱及作为增敏剂增强肿瘤放疗的机制。第一章金纳米颗粒载体体系的研制及其对宫颈癌和卵巢癌细胞放疗增敏的体外研究目的研制一种具有肿瘤细胞靶向作用的金纳米颗粒载体系统,用于宫颈癌和卵巢癌细胞体外放射毒性作用的研究。材料与方法1、以四氯金酸(HAuCl4)为原材料,在特定条件下,还原剂柠檬酸钠盐将金原子从溶液中还原出来并积聚成纳米颗粒(GNPs)。常温下GNPs与巯基葡萄糖(G1u)和巯基聚乙二醇(PEG)混合静置,至少12h,制备Glu-GNPs或Glu-PEG-GNPs。,透射电子显微镜(TEM)和动态光反射(DLS)测定金颗粒的分布和大小,电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定溶液中Au元素含量。X射线光电能谱仪(XPS)检测Glu和PEG与GNPs是否成功结合。2、分别培养卵巢癌细胞SK-OV-3,宫颈癌细胞SiHa和HeLa,三种细胞分别与Glu-GNPs和裸GNPs(对照组)孵育,终浓度均为5nM。于不同时间点终止孵育,收集细胞并计数,浓硝酸消化细胞,稀释后测定溶液中Au含量。分别计算三种细胞在各个时间点时摄取的金颗粒数目。3、分别培养三种细胞,分别给予不同剂量的X-射线照射,X-射线分别来源于低电压(90Kvp)和高电压(6MV)X-射线机。照射后,MTT法检测细胞的短期存活率,细胞克隆形成法检测细胞长期存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡和周期的变化,细胞内产生的ROS与一种荧光探针(CM-H2-DCFH-DA)作用,激发的荧光变化通过共聚焦显微镜显像出来。结果1、制备金纳米颗粒的条件为,控制温度稳定在120℃～140℃,磁力转子搅拌速度为300转/分钟,反应体系为195ml三蒸水,4ml25mMHAuCl4溶液和lml34mM柠檬酸钠溶液。TEM和DLS测定GNPs直径为14.4±2.5nm,调整反应条件后也可制备得到直径为20nm的金颗粒。ICP-AES测定制备出GNPs溶液中Au含量为81.92±2.26μg/m1,平均回收率91.74%。XPS检测显示Glu和PEG均偶联在GNPs表面,PEG:Glu:Au=0.06:0.6:1。2、SKOV-3细胞、SiHa细胞和HeLa细胞与GNPs/Glu-GNPs孵育后,细胞生长未受到明显抑制。三种细胞摄取Glu-GNPs明显多于摄取GNPs,增幅依次为SK-OV-3细胞31%(P<0.005),SiHa细胞45.6%(P<0.005),HeLa细胞24.5%(P<0.005)。三种细胞的达峰时间不同,SiHa细胞12h,HeLa细胞48h,SK-OV-3细胞48h。3、Glu-GNPs在两种来源的X-射线作用下对细胞均有增强细胞放射毒性的作用。用6MV X-射线照射,Glu-GNPs对HeLa细胞和SK-OV-3细胞的平均增敏率分别为17.4%和26.9%；用90kvp X-射线照射,Glu-GNPs对SiHa细胞和SK-OV-3细胞的平均增敏率分别为26.8%和30.5%。流式细胞仪检测提示Glu-GNPs能调控细胞周期处于对放射线敏感的G2/M期,其百分比值由9.28%增至20.52%。GNPs在X-射线激发下增加细胞凋亡比值,联合治疗组细胞凋亡比值为18.57±1.44%,远远大于单纯X-射线组的14.35±0.90%(P=0.003)。GNPs在X-射线的激发下显著增加细胞内ROS的产生,共聚焦显微镜成像分析显示：Glu-GNPs在90Kvp X-射线(8Gy)激发下,将荧光强度由5.1倍增加到8.3倍；在6MV X-射线(8Gy)激发下,将荧光强度由3.4倍增加到7.8倍。结论1.本实验成功制备了GNPs载体体系,细胞摄取Glu-GNPs明显多于摄取裸露的GNPs。2. GNPs载体对SKOV-3细胞、SiHa细胞和HeLa细胞无明显暗毒性。3. GNPs在X-射线的激发下能诱导细胞内产生大量的ROS,增强放射细胞毒性作用。第二章金纳米颗粒的药代动力学和组织分布研究及其对裸鼠皮下宫颈癌放疗增敏作用的体内实验研究目的研究GNPs载体的药代动力学特性和生物组织分布特性,探讨GNPs载体在体内是否具备增强宫颈癌放射治疗的作用。材料和方法1、Balb/c裸鼠分三组,分别经尾静脉注射GNPs, Glu-GNPs和PEG-Glu-GNPs溶液,分别于下列不同时间点：5min,30min,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,48h,72h,96h,麻醉裸鼠后通过眼底静脉丛取血(每次2滴)。样品经过20%的浓硝酸处理后,用ICP-AES测定Au元素的浓度,计算血液中Au元素浓度。用DAS2.1.1软件进行纳米颗粒的药代动力学分析。2、建立Balb/c裸鼠荷载SiHa皮下瘤模型,尾静脉注射PEG-Glu-GNPs溶液,分别于不同时间点：5min,1h,6h,12h,24h,48h,1-month,处死小鼠(每个时间点3只),并取收取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉、子宫卵巢、腹腔淋巴结、肿瘤组织、血液和肠管粪便。样品经过20%的浓硝酸处理后,用ICP-AES测定Au元素的浓度,计算不同组织样品中金颗粒的分布情况。3、建立Balb/c裸鼠荷载SiHa皮下瘤模型后,随机分四组给予不同处理：空白对照组、单纯GNPs组、单纯X-射线组和GNPs联合X-射线组,定期称量裸鼠体重,测量肿瘤大小,绘制体重-时间曲线图和肿瘤体积-时间曲线图。分析各组裸鼠生存状况和肿瘤生长差异。结果1、DAS2.1.1分析GNPs的t1/2为1.07±0.22h,Glu-GNPs的t1/2为1.23±0.14h,PEG-Glu-GNPs的t1/2为6.17±3.71h。PEG-Glu-GNPs在裸鼠体内的CL=0.003±0.001L/h。2、组织分布研究发现多数PEG-Glu-GNPs主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结等内皮网状系统,峰值分别为55.58±2.55ug/g、117.95±3.56ug/g、15.32±1.78μg/g和6.23±0.66μ/g；肿瘤组织中亦有分布,峰值达9.22±2.41μg/g。PEG-Glu-GNPs在宫颈癌模型的肿瘤组织中的分布是正常宫颈和卵巢组织中的20倍。TEM照片证明颗粒进入细胞积聚在细胞器中。3、PEG-Glu-GNPs对Balb/c裸鼠无明显毒性作用,空白对照组和单纯GNPs组的肿瘤生长无显著区别,裸鼠生长状态无差别(P>0.05)。PEG-Glu-GNPs联合X-射线组的肿瘤大小为769±92(mm3),远远小于单纯X-射线组的1432±269(mm3)和对照组的3514±1818(mm3)(P<0.05)。PEG-Glu-GNPs的体内放疗增敏率达46.3%。结论1.制备的PEG-Glu-GNPs纳米颗粒载体具有良好的药代动力学特性和生物组织分布特性。2.PEG-Glu-GNPs能够到达肿瘤区域并积聚于此,能增强对宫颈癌的放射治疗。第三章金纳米颗粒在肿瘤的X射线断层扫描技术(CT)显像中的实验研究目的研究PEG-Glu-GNPs能否靶向性积聚在肿瘤部位,具备增强CT显像的作用。材料和方法1.建立Balb/c裸鼠荷载SiHa皮下瘤模型,实验分两组,一组作空白对照,另一组作实验组,通过尾静脉注射PEG-Glu-GNPs溶液。分别于不同时间点：24h,7天,15天,对两组小鼠进行Micro-CT扫描。2.根据扫描所得数据,利用数据重构软件NReconServer和CTvox ver.2.3重构出CT三维图像,直观分析CT三维图像,分析金颗粒在体内的分布状态。3、用Photoshop软件在重构的三维图像中选取特定位点,求得该位点的灰度百分比值,利用公式计算图像中位点的CT值,数值化分析CT三维图像,分析金颗粒在体内的分布状态。结果1、直观分析扫描重构的CT三维图像,对照组的图像中肿瘤组织与周围正常组织的差别不明显,不能将两者区分。实验组在24h的图像中肿瘤区域亮度较高,与周围正常组织的界限清楚；7天时的图像中肿瘤区域的亮度降低,但仍高于正常组织；15天时的图像中肿瘤区域与周围正常组织差异明显,界限不清楚。2、数值化分析扫描重构的CT三维图像,对照组肿瘤部位的CT值为150HU,皮质骨的CT值接近3000HU,基本稳定不变。实验组24h的图像中肿瘤部位的CT可达2160HU,7天和15天的图像中肿瘤部位的CT值降低至400HU-500HU。肿瘤部位的CT值的变化提示体内PEG-Glu-GNPs的分布变化。结论PEG-Glu-GNPs靶向性地积聚于肿瘤区域,增强CT显像作用。