【摘 要】
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真菌毒素是由真菌产生的天然化学物质,具有致癌、肝毒性等作用,对人和动物的健康构成巨大威胁。因此,谷物中真菌毒素污染检测显得十分重要。免疫分析技术检测速度快、操作简单、价格低廉,特别适合大批量样本的现场快速检测。本研究以常见的玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和伏马毒素B1（FB1）四种真菌毒素为研究对象,制备高亲和性单克隆抗体,并开发了间接竞争酶联免疫吸附
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真菌毒素是由真菌产生的天然化学物质,具有致癌、肝毒性等作用,对人和动物的健康构成巨大威胁。因此,谷物中真菌毒素污染检测显得十分重要。免疫分析技术检测速度快、操作简单、价格低廉,特别适合大批量样本的现场快速检测。本研究以常见的玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和伏马毒素B1（FB1）四种真菌毒素为研究对象,制备高亲和性单克隆抗体,并开发了间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）和荧光免疫层析检测方法（FICA）,应用于谷物中四种真菌毒素的检测。（1）通过分析ZEN、OTA、DON和FB1的结构特点,设计并衍生相应的半抗原。经质谱鉴定后,将半抗原与载体蛋白偶联以合成完全抗原,并用于小鼠免疫实验。通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,最终得到抗ZEN抗体2F6、抗OTA抗体3G3、抗DON抗体1C8和抗FB1抗体3A8,其对应的抗体亚型分别为Ig G2b、Ig G2b、Ig G1和Ig G2a,亲和力常数Ka分别为7.98×10~8 L/mol、6.00×10~8 L/mol、6.64×10~8 L/mol和1.15×10~9 L/mol。（2）基于制备出的单克隆抗体,建立相应的ic-ELISA检测方法,并对标准品稀释液中的Na Cl含量和甲醇含量进行优化。在最优条件下,ZEN、OTA、DON、FB1单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50)分别为0.034 ng/m L、0.137 ng/m L、1.565 ng/m L和0.484ng/m L,检测范围分别为0.014～0.083 ng/m L、0.04～0.464 ng/m L、0.397～6.166 ng/m L和0.072～3.244 ng/m L。ZEN 2F6与玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应率分别为87.2%、75.6%、64.2%、82.9%和54.8%;OTA 3G3与赭曲霉毒素B和赭曲霉毒素C的交叉反应率分别为7.4%和65.2%;DON1C8与3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率为145.8%,与其它类似物的交叉反应率均小于2%;FB1 3A8与FB1类似物的交叉反应率均小于5%。添加回收实验表明,使用ic-ELISA检测玉米和小麦样本时,ZEN、OTA、DON和FB1的回收率均在80%～120%之间,变异系数均小于10%。（3）基于制备出的单克隆抗体,以荧光微球为抗体标记物,建立相应的荧光免疫层析试纸条,并对包被原浓度和表面活性剂进行优化。在最优条件下,ZEN、OTA、DON和FB1试纸条检测玉米样本时的检测限（c LOD）分别为0.68μg/kg、0.57μg/kg、0.53μg/kg和0.76μg/kg,检测小麦样本时的c LOD分别为0.48μg/kg、0.85μg/kg、0.70μg/kg和0.58μg/kg。添加回收实验表明,使用荧光免疫层析试纸条检测玉米和小麦样本时,ZEN、OTA、DON和FB1的回收率均在80%～120%之间,变异系数均小于10%。使用荧光免疫层析试纸条检测实际阳性谷物样本,并与LC-MS/MS方法比对,结果表明所开发的荧光试纸条完全满足谷物中四种真菌毒素的实际检测需求。
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