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研究背景:越来越多的研究发现,经典的Wnt/β-catenin信号通路在骨发育及骨量调节过程中发挥着重要作用,激活Wnt/β-catenin可得到骨量增加的表型,而抑制Wnt/β-catenin活性骨量减少,这显示出在低骨量疾病的治疗中拥有良好的前景。成骨细胞是骨发育过程中最主要的功能细胞,而骨细胞是骨组织中含量最多的细胞成分。因而我们认为有必要在成骨细胞及骨细胞特异性的激活Wnt/β-catenin来观察其对骨量的影响。有意思的是本研究发现无论是在成骨细胞还是骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin后虽然骨量显著增多但出现骨矿化差,胶原形成不佳等骨质量下降的表型。其导致骨质量下降的机制尚无相关研究报道,鉴于矿化主要发生在成骨细胞终末分化阶段,我们认为有必要观察持续激活Wnt/β-catenin对成骨细胞终末分化的影响及探讨可能机制。另外,骨折的愈合过程近似于胚胎时期骨形成过程。近年来多项研究发现Wnt/β-catenin信号通路在骨折愈合过程中同样发挥重要作用,增强该信号通路活性可促进骨折愈合,而降低该信号通路活性则会导致骨折愈合欠佳。骨折愈合过程大致可分为炎症血肿期、修复期、重塑期三个阶段。其中重塑期所占比例最长,重塑的好坏也将直接导致骨折愈合的质量,但目前尚没有相关研究报道Wnt/β-catenin信号通路在重塑期中的作用。因而我们试图在骨折重塑期通过激活和敲除β-catenin来观察其对重塑期的影响。综上所述,目前已经证实Wnt/β-catenin信号通路在骨发育及骨折愈合过程中具有非常重要的作用,但是仍然存在许多问题。因此我们将进行下列实验:1、观察在成骨细胞中持续激活β-catenin对骨质量的影响并探讨其机制;2、建立小鼠胫骨骨折模型,并在骨折重塑期分别激活和敲除Wnt/β-catenin以观察对重塑期的影响及探讨其发生机制。实验方法:第一部分:Wnt/β-catenin在成骨细胞终末分化中的作用第一节:骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin(oc CA-β-catenin)对骨量及骨质量的影响1.建立骨细胞特异性持续激活β-catenin小鼠模型,μ-CT、HE染色检测小鼠骨量变化;2.三点弯曲试验测试小鼠长骨生物力学特性;3.免疫组织化学染色检测一型胶原(Col1a1)、FGF23的表达;第二节:成骨细胞中持续激活Wnt/β-catenin(ob CA-β-catenin)对成骨细胞终末分化的影响1.建立成骨细胞特异性持续激活β-catenin小鼠模型,采用三点弯曲试验测试小鼠长骨生物力学特性;2.Masson,Sirius Red染色查看胶原形成及排列情况;3.硬组织切片von Kossa染色观察骨组织矿化情况;4.BrdU免疫组织化学和免疫荧光检测成骨细胞增殖情况,TUNEL法观察成骨细胞凋亡情况;5.利用免疫组织化学染色检测成骨细胞早期分化标志物Run X2、Osterix,晚期标志物Osteocacin、DMP1,一型胶原Col1a1,细胞周期相关因子c-myc、cyclin Y的表达情况,并检测Wnt/β-catenin信号抑制因子Dkk1的表达;6.小鼠长骨原代成骨细胞分离培养,于ob CA-β-catenin成骨细胞的培养基中加入外源性DKK1,成骨诱导后茜素红染色观察矿化水平;7.分离培养的成骨细胞提取总RNA及总蛋白分别进行实时定量PCR及Western Blot检测周期相关基因及蛋白质的表达水平。第二部分:Wnt/β-catenin信号通路在骨折重塑期中的作用1.繁育可在成骨细胞中分别激活和敲除β-catenin的基因小鼠;采用8周大小鼠建立骨折二期愈合模型,8周后取材;2.小鼠分组:高激活β-catenin组(HA-β-catenin)、低激活β-catenin组(LA-β-catenin)、敲除β-catenin组(β-catenin-KO),采用同窝野生型小鼠作为对照组(control),运用实时定量PCR检测骨痂处β-catenin水平;3.骨折后8W取材,X线摄片、μCT观察骨折愈合情况,HE染色观察骨痂形态,Sarfanin O染色观察骨痂处软骨含量,Masson,Siruis red染色观察骨痂处胶原情况;4.三点应力实验检测骨折愈合质量;5.硬组织切片von Kossa染色观察骨痂处骨组织矿化情况;6.TRAP染色观察破骨细胞;7.免疫组化观察ALP、Runx2、OSX、OCN的表达情况;8.提取骨痂处总RNA实时定量PCR检测ALP、Runx2、OSX、OCN、DMP1、RANKL、OPG的表达;9.提取血清ELISA检测ALP、CTXⅠ水平。实验结果:一、持续激活β-catenin可使骨量增加但会造成成骨细胞终末分化障碍、骨质量下降,DKK1在此过程中发挥着重要作用第一节:骨细胞中持续激活β-catenin骨量增多、骨质量下降1.μ-CT、HE染色结果显示oc CA-β-catenin小鼠长骨骨量增加;2.三点应力实验显示oc CA-β-catenin小鼠长骨断裂载荷及刚度较control组显著下降;3.Sirius染色显示oc CA-β-catenin小鼠长骨胶原排列紊乱;4.免疫组化染色显示oc CA-β-catenin小鼠长骨Col1a1,矿化相关指标FGF23表达下降;第二节:成骨细胞中持续激活β-catenin引起成骨细胞终末分化障碍、DKK1在此过程中发挥着重要作用1.三点应力实验显示ob CA-β-catenin小鼠长骨断裂载荷及刚度较control组显著下降;2.ob CA-β-catenin小鼠长骨胶原排列紊乱,矿化差,Col1表达下降;3.免疫组化染色显示ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞早期分化指标Runx2、OSX表达上升,晚期分化指标OCN、Dmp1表达下降;4.ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞增殖增多而凋亡减少;5.ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞中细胞周期相关因子c-myc、cyclin D1、cyclin Y、CDK14的表达升高;6.在体外培养的成骨细胞中加入外源性DKK1后ob CA-β-catenin小鼠成骨细胞细胞周期相关因子的表达下调至control组水平,矿化增强。二、Wnt/β-catenin信号通路在骨折重塑期需要被精确的调控1.X线检测发现与control组相比β-catenin-KO小鼠骨折处骨痂量显著减少,HA-β-catenin小鼠骨折处骨痂量明显增多,LA-β-catenin小鼠骨痂处骨量轻微增多,而Micro CT检测显示BV/TV值LA-β-catenin小鼠最大其次是Control组小鼠,再次是HA-β-catenin小鼠,β-catenin-KO小鼠最小;2.Sarfanin O染色显示HA-β-catenin小鼠骨痂处有软骨成分;3.Masson及Siruis red染色显示HA-β-catenin、β-catenin-KO小鼠骨痂处胶原减少,排列紊乱,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异;4.三点应力试验表明断裂载荷及刚度值LA-β-catenin小鼠>control小鼠>HA-β-catenin小鼠>β-catenin-KO小鼠;5.硬组织切片von Kossa染色显示HA-β-catenin、β-catenin-KO小鼠骨痂处骨痂矿化差,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异;6.TRAP染色显示HA-β-catenin小鼠破骨细胞明显减少,β-catenin-KO小鼠破骨细胞显著增多,而LA-β-catenin小鼠与control小鼠无明显差异,血清ELISA检测CTXⅠ同样证实上述发现;7.免疫组化染色显示HA-β-catenin小鼠骨痂处ALP、Runx2、OSX表达较其他组高,而OCN表达下降,LA-β-catenin小鼠骨痂处的ALP、Runx2、OSX略高于control组、但OCN表达较其他组高,β-catenin-KO小鼠上述指标均降低,此外实时定量PCR也证实了上述指标的变化。结论:1.骨细胞及成骨细胞中持续激活β-catenin骨量增加但骨质量降低;持续激活β-catenin导致成骨细胞周期相关因子的表达上调,促使细胞一直处于增殖状态而无法脱出细胞周期进行分化,成骨细胞增殖增多使骨量增加而成骨细胞终末分化受阻,造成胶原形成不佳、矿化下降等骨质量下降表现。2.DKK1在成骨细胞终末分化的过程中发挥着重要作用,在成骨细胞分化晚期DKK1需表达上升使Wnt/β-catenin信号通路活性下降从而使成骨细胞脱出细胞周期继续分化。3.在骨折重塑期Wnt/β-catenin信号通路发挥着重要作用,但β-catenin水平需要被精确调控以促进骨折愈合,过高或过低β-catenin水平都不利于骨折愈合。