氟苯尼考与磺胺二甲嘧啶胁迫下土壤与水体沉积物中氮循环及ARGs响应特征

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抗菌药在畜禽养殖生产中的大量使用,使得动物体及养殖场周围环境中的抗生素耐药菌日益增加,对人类健康和公共卫生安全造成威胁。氮循环是生态系统中重要的物质循环之一,抗菌药在环境中的残留一定程度上阻碍氮循环进程,进而影响氮素平衡,扰乱环境微生物群落的功能代谢。本文立足此背景,分别构建了氟苯尼考(FFC)-粪便-土壤模型与磺胺二甲嘧啶(SM2)-沉积物模型,通过30 d的短期孵育试验,研究不同浓度抗菌药添加对沉积物、土壤两种生境中氮循环进程及其抗生素耐药性的影响。总的来说,这些研究结果为抗菌药胁迫下的环境微生物生态学提供了一个较详细的视角。同时为养殖场合理使用兽用抗菌药提供理论指导,也为评估抗菌药引发微生物耐药性导致的环境生态风险提供参考数据。取得的主要研究结果如下:(1)FFC胁迫下土壤中氮循环及ARGs响应特征以FFC为胁迫因子,构建室内粪便-土壤模型,分别设空白组(0μg/kg)、低浓度药物组(0.167μg/kg)和高浓度药物组(16.67μg/kg),每组重复三次。分别于第1、3、7、14和30 d进行样品采集。采用宏基因组学和q PCR等技术分析FFC对土壤微生物耐药性和氮循环进程的影响。结果显示:低浓度FFC对土壤氮循环功能基因抑制范围广,而高浓度FFC抑制程度较大。此外,高浓度FFC明显提高土壤中flo R、fex B、fex A耐药基因的丰度。FFC诱导了土壤微生物呈现不同的耐药图谱,表现在初期(1~3 d)部分优势ARGs类型丰度发生显著变化,且不同程度地改变了sul1、sul2、tet(M)、optr A四种优势耐药基因宿主菌的分布模式。研究还发现了高浓度FFC显著改变变形菌、放线菌、拟杆菌和厚壁菌菌群丰度,其中明显降低鞘脂单胞菌科中各类菌属丰度。值得注意的是,有机质是影响土壤优势菌属分布的主导因素。FFC可降低蛋白质代谢功能,并影响大部分氮代谢功能;在氮代谢通路中,NO还原酶在FFC的胁迫下较敏感于其它酶,相关酶包括硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和一氧化二氮还原酶亦呈现轻度响应。此外,FFC对携带氮循环基因丰度较高的菌属的影响随孵育时间延长而发生变化。(2)SM2胁迫下水体沉积物中氮循环及ARGs响应特征以SM2为胁迫因子,构建室内水体模型,分别设空白组(0μg/L)、低浓度药物组(50μg/L)和高浓度药物组(1000μg/L),每组重复三次。于第1、3、5、7、10 h和第1、3、7、15、30 d进行沉积物样品采集。采用q PCR与16S r RNA基因高通量测序分析SM2对沉积物中微生物耐药性与氮循环进程的影响。结果显示:SM2抑制了水体沉积物中的硝酸盐还原量,表现在30 d孵育末期,低浓度和高浓度SM2水平下分别被抑制26%和21%。在30 d孵育末期,高浓度SM2显著增加了沉积物中sul2基因的相对丰度(ANOVA test at Tukey HSD,P<0.05)。药物与空白处理对水体沉积物中反硝化、硝酸盐异化还原成铵(DNRA)功能基因丰度的影响表现在:DNRA功能基因nrf A、反硝化功能基因nos Z和nar G在药物组与空白组中的差异随孵育时间延长而下降,30 d后变化不显著;反硝化功能基因nir K丰度则随时间延长而增加,至30 d呈现显著差异。16S r RNA基因高通量测序显示空白组的物种丰富度与多样性均高于SM2组。优势菌群如放线菌、广古菌、芽单胞菌、硝化螺旋菌、伯克氏菌和Thermoanaerobaculaceae的相对丰度在孵育期间药物组均低于空白组。相关性分析表明:沉积物中多种氮循环基因与磺胺类耐药基因密切相关,磺胺耐药基因主要选择intl1在细菌群落间发生水平转移。此外,放线菌、拟杆菌、蓝藻细菌、ε-变形菌、广古菌、厚壁菌、芽单胞菌、螺旋体、红环菌、SC-I-84、互营菌和Thermoanaerobaculaceae在氮转化进程中扮演着重要的角色。综上所述,兽用抗菌药进入菜地土壤、水体沉积物,均会引起抗生素耐药性增强,主要体现在特定耐药基因亚型丰度变化显著。ARGs在宿主菌的定植随时间变化,造成环境样品随时间延长呈现不同的耐药图谱。功能基因携带宿主菌的同时也会携带耐药基因参与整个氮循环。此外,抗菌药在土壤与沉积物中的残留造成活性氮积累、部分氮循环功能基因丰度下降、氮循环宿主分布紊乱、氮功能代谢减弱现象。
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