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电致化学发光适配体传感器是以适配体为分子识别元件,利用固定化方法将参与电化学发光反应的试剂固定在传感器表面,然后通过测定其发光强度完成对待测物定量检测的一类新分析器件。它将电致化学发光技术与适配体的高特异性和亲和性融合在一起,具有高灵敏度、高选择性、低背景信号等特点。本文拟以复合纳米材料为载体,通过吸附、交联等固定化方法增加直接或者间接参与电化学发光反应的试剂固载量,从而构建简单、可靠、快速、高灵敏度的信号增强型(signal on)和信号减小型(signal off)电致化学发光适配体传感器用于凝血酶的检测。本文所做的研究工作包括以下几个部分：1基于纳米金和L-Cys催化放大联吡啶钌电致化学发光构建凝血酶适体传感器的研究分子自组装膜具有类似生物膜的特性,且稳定性较高,现已成为电化学及电分析化学研究领域的一个热点。在该研究体系中,我们利用电聚合的方法将L-Cys自组装在电极表面以促进电子传递及增强电致化学发光效率,再通过电沉积一层纳米金,用于固载修饰有巯基的凝血酶适体链。此时,利用杂交互补配对将标记有氨基化联吡啶钌(Ru-NH2)的凝血酶互补链修饰在电极表面,由于纳米金和L-Cys对Ru-NH2发光的增强作用,传感器在硼酸缓冲溶液中检测表现出较强的电致化学发光信号。当传感器与目标物凝血酶结合时,传感器表面的凝血酶适体捕获目标分子后迫使氨基联吡啶钌标记的凝血酶互补链离开电极表面,同时电极表面空间位阻增大,因此得到减弱的电致化学发光信号。我们就可以根据电致化学发光信号的降低来定量检测凝血酶的浓度。从实验的结果来看,所设计的适体传感器具有较高的灵敏度,检测范围为1×10～1.5×10-8mol/L,检出限为0.3pmol/L (S/N=3)。2基于4-(二甲基氨基)丁酸和铂纳米颗粒促进联吡啶钌电致化学发光构建凝血酶适体传感器的研究4-(二甲基氨基)丁酸(DMBA)和铂纳米颗粒(PtNPs)对联吡啶钌发光具有很强的催化作用。我们基于目标物诱导适体链置换反应,以4-(二甲基氨基)丁酸(DMBA)和铂纳米颗粒(PtNPs)为增强剂,成功构建了高灵敏电致化学发光适体传感器。该适体传感器主要包括三个部分：固态ECL响应平台,发光强度放大和目标物诱导的适体链置换反应。固态ECL响应平台是将纳米铂和三联毗啶钉(Ru(bpy)32+)所形成的复合物(Ru-PtNPs)通过静电吸附作用修饰在Nafion分散的多壁碳纳米管(nafion@MWCNTs)电极表面,然后将凝血酶适体与DMBA@PtNPs标记的凝血酶适体互补链(Aptamer Ⅱ)所形成的双链(TBA-Aptamer Ⅱ)组装在修饰的电极表面以增大发光强度。当传感器与目标物凝血酶结合时,Aptamer Ⅱ的复合物从杂交链上置换下来释放到溶液中,惰性的凝血酶蛋白组装到电极表面。适体传感器上DMBA@PtNPs量的减少以及结合的凝血酶对电子传递阻碍作用引起了ECL强度的急剧降低。由于DMBA和PtNPs对Ru(bpy)32+的ECL信号的协同放大作用,所构建的适体传感器在孵育凝血酶前后有明显的ECL信号差异,显著提高了传感器的灵敏度。实验结果表明,ECL信号的改变与凝血酶浓度的对数在0.001-30nmol/L的范围内成线性关系,检出限达到0.4pmoI/L。该传感器有望被广泛用于临床和生物分析中对蛋白质检测。3基于二茂铁标记的分子信标猝灭联吡啶钌电致化学发光构建凝血酶适体传感器的研究β-环糊精(β-CD)有着锥形的中空圆筒立体环状结构,它的外体和腔体分别具有亲水性和疏水性,这使得环糊精可以作为主体去容纳相应的客体并改变其物理化学性质。利用这个特性,我们构建了二茂铁标记的分子信标猝灭联吡啶钉的电致化学发光适体传感器用于凝血酶的定量检测。在该实验体系中,Nafion分散的多壁碳纳米管(CNTs/Nafion)作为固载基质首先修饰在电极表面,然后把β-环糊精与Ru(bpy)32+形成的复合物通过静电吸附作用修饰在CNTs/Nafion膜电极表面。这里,我们采用分子识别技术,将一端修饰有二茂铁(Fc)的凝血酶适体分子信标作为目标物分子识别探针。在孵育目标物凝血酶后,致使分子信标结构发生改变,二茂铁(Fc)与β-环糊精(β-CD)结合,有效地猝灭了Ru(bpy)32+的ECL。根据ECL发光强度的降低我们就可以完成对凝血酶的定量检测。本实验设计的传感器对目标物的检测范围为0.1pmol/L～20nmol/L,检测限达0.03pmol/L (3σ)。4原位产生脯氨酸促进联吡啶钌电致化学发光构建超灵敏适体传感器研究原位产生共反应试剂可有效增强电致化学发光强度,提高检测灵敏度。在该体系中,我们利用含有大量叔氨基团的树枝状聚合物PAMAM固载Ru-PtNPs以增大其固载量,然后利用生物素与PtNPs之间的作用将生物素标记的脯氨酸肽酶(GDPA)修饰在其表面。通过生物素和亲和素的桥联作用固载亲和素标记的凝血酶适体链以形成第二适体。最后采用夹心式模式构建了原位产生脯氨酸(Pro),由于Pro是一种仲胺类物质,可以催化联吡啶钌及其衍生物的电致化学发光,因此,在检测底液中加入底物甘氨酸-D-脯氨酸(GDP)之后,电极表面的GDPA催化其原位产生Pro,有效地提高了联毗啶钌的电致化学发光强度,从而达到灵敏检测目标物的目的。实验结果表明该传感器对凝血酶的检测范围为1×10-14～1×10-8mol/L,检出限为3.3fmol/L。5基于3,4,9,10-苝四甲酸二酐功能化石墨烯标记适体构建过硫酸根电致化学发光适体传感器的研究我们以3,4,9,10-苝四甲酸二酐(PTCDA)功能化的石墨烯复合物作为一种新型的标记物标记凝血酶适体(TBA)以形成第二适体链(Apt II),然后通过夹心反应成功地构建了超灵敏的电致化学发光适体传感器用于凝血酶的定量检测。石墨烯较大的比表面积为PTCDA和TBA的大量固载提供了好的稳定性和生物相容性。此外,石墨烯具有良好的电子传导能力,与具有良好光学性能的PTCDA形成的生物共轭物可以有效催化放大过硫酸根(S2O82-)的电致化学发光信号,从而在检测凝血酶时得到1fmol/L到1nmol/L的较宽检测范围和0.33fmol/L的超低检测限。而且,该适体传感器具有很好的选择性和稳定性,在疾病的早期诊断过程中检测超痕量水平的凝血酶具有很大的应用潜力。