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猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起仔猪呕吐、腹泻、脱水、肠绒毛萎缩,高死亡率为特征的高度接触传染性疾病,两周龄以下的仔猪感染死亡率达100%,成年猪带毒不发病,但是生长缓慢,不断排毒,免疫力低下,会继发感染其它病原,该病给我国养猪业造成巨大的损失。TGEV主要感染肠上皮细胞,但是其入侵机制还不清楚,细胞微丝骨架在介导病毒入侵过程中发挥着重要的作用,本实验之前研究发现TGEV感染早期能够引起肠上皮细胞微丝骨架的大量重排,但对其具体调控机制还不清楚。病毒入侵宿主细胞的第一步是同细胞膜表面受体结合,越来越多的研究发现病毒入侵宿主细胞可能需要多个受体的协同。本研究以猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为感染模型,探索TGEV调控微丝骨架重排的机制以及TGEV入侵新受体,为防控TGEV提供一定的理论依据,本研究内容分为以下四个部分:1、TGEV SHXB毒株全基因组测序分析TGEV SHXB毒株分自中国上海,为了进一步了解其遗传进化信息,对其全基因组序列进行测序,将其序列同GenBank中已经收录的毒株序列进行了比对,比对结果显示在5’和3’非编码翻译区,非结构蛋白ORF1,ORF3和ORF7,结构蛋白E蛋白,M蛋白和N蛋白的基因组均没有外源插入或缺失;同其它毒株共有的现象是S基因第655位核苷酸都是鸟嘌呤(G ),第1753位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突变成乌嘌呤(G ),造成第585位置丝氨酸突变成丙氨酸,该位置是S蛋白A, B抗原位点;除了 purdue强毒株(Virulent Purdue)以外所有purdue毒株在第核苷酸1123-1128处存在6个核苷酸的缺失;进化树分析发现SHXB毒株同purdue毒株进化上很靠近,同Miller毒株和猪呼吸道病毒PRCV-ISU-1毒株来源于同一祖先。2、TGEV感染早期引起IPEC-J2细胞微丝骨架的重排细胞的形状、运动、吞噬、细胞器以及细胞间的交流都需要微丝骨架的参与。已经有报道发现许多病毒感染引起微丝的重排,微丝在介导病毒入侵和内化过程中起着重要的作用。荧光显微镜观察发现TGEV (MOI = 2)感染引起微丝重排,细胞皮质层微丝重排,皮质层微丝的变化使细胞膜表面形成丝状伪足,层状伪足,片状伪足,电镜观察发现微丝围绕在病毒周围,共聚焦显微镜观察发现病毒能够同微丝共定位,利用微丝骨架蛋白抑制剂处理细胞能够显著的抑制TGEV的入侵(p< 0.01),表明TGEV入侵早期能够调控宿主细胞微丝骨架的排列,同时微丝骨架蛋白在TGEV入侵过程中发挥着重要的作用。cofilin是一种微丝解聚调控因子家族成员,其在调控微丝骨架蛋白解聚过程中发挥着重要的作用,本研究发现TGEV感染早期能够引起cofilin磷酸化水平上升,过表达,干扰以及定点突变cofilin显著抑制TGEV的入侵(p< 0.01 ),干扰cofilin能够显著的抑制TGEV对微丝骨架的破坏,表明TGEV感染早期通过cofilin来调控微丝骨架。3、TGEV引起IPEC-2细胞微丝骨架重排机制的研究TGEV感染早期引起IPEC-J2细胞皮质层微丝骨架重排,细胞应力纤维丝消失,微丝骨架蛋白参与TGEV早期入侵的调控,微丝解聚因子cofilin在该过程中发挥着重要的作用。我们进一步探索了 TGEV感染早期对cofilin的调控机制,定点突变Rho-GTPases家族显著的抑制TGEV的入侵(p < 0.05 ),Racl和Cdc42参与了对cofilin的早期调控;Rho-GTPases家族上游调控激酶PI3K抑制剂显著抑制TGEV的入侵(P<0.01 ),PI3K参与对cofilin的早期调控;表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是酪氨酸家族(RTK)成员之一,本研究发现TGEV感染早期能够激活细胞膜表面EGFR,同EGFR共定位,抑制EGFR的活性能显著的抑制TGEV的入侵(p < 0.01)和下游信号通路的激活,表明EGFR参与了 TGEV的入侵和cofilin的调控;脂筏(LipidRaft)主要由鞘磷脂和胆固醇组成,通过脂筏抑制剂去除细胞膜表面脂筏能够显著的抑制TGEV的黏附和入侵(p < 0.01),TGEV感染早期促使脂筏的簇集,脂筏聚集在EGFR周围,去除脂筏能够显著的抑制TGEV对EGFR和下游信号通路的激活,表明脂筏参与了 TGEV早期对cofilin和微丝骨架的调控。结果表明TGEV感染早期通过EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信号通路来调节cofilin,进而对微丝骨架进行调控,促进病毒的入侵。4、EGFR介导TGEV入胞机制的研究TGEV感染早期通过EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信号通路来调节cofilin,对微丝骨架进行调控,介导病毒的入侵。氨肽酶N(APN)是TGEV已知的一个受体,本章进一步研究发现同时干扰APN和EGFR能更显著的抑制TGEV的入侵(p <0.01),EGFR的受体结合域1蛋白同TGEV作用后能够显著抑制TGEV入侵(p< 0.05),TGEV的S1蛋白能够同EGFR胞外区受体结合域1 ( Receptorl )互作;TGEV感染早期能够促使APN和EGFR簇集,EGFR下游PI3K/AKT和ERK1/2信号通路参与了TGEV内吞的调控;干扰APN受体能够显著的抑制TGEV对EGFR的激活,APN对EGFR下游内吞信号的刺激起到协同作用;干扰小窝蛋白和网格蛋白都能显著的抑制TGEV的入侵(p < 0.01),说明TGEV能通过小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞途径内陷到胞质;正常的细胞中有大量的EGFR存在细胞膜上,TGEV感染早期能够引起大量的EGFR内陷,干扰网格蛋白抑制EGFR的内陷,证明TGEV同EGFR结合后通过网格蛋白介导的内吞途径进入胞质。结果表明:EGFR是TGEV入侵的另外一个受体,同APN.起着协同作用。