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背景和目的：肝硬化是目前治疗的难题,由于多种原因引起氧气和养料缺乏导致肝细胞再生障碍在这其中有着决定性的作用。Rac1属于Rho GTP酶家族成员之一,众多研究显示Rac1在多种肿瘤细胞内具有调节肌动蛋白细胞骨架重组,导致细胞板状伪足形成和膜褶皱样运动,影响细胞形体极化,促进细胞运动与迁移,从而诱导上皮细胞向间质细胞转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)。研究显示EMT通过赋予细胞迁移和浸润性,诱导出干细胞性质,阻止凋亡和衰老。因此我们推测Rac1能通过促进肝细胞发生EMT,诱导出干细胞性质,从而促进肝细胞再生。Rac1有两个突变体,一个是持续激活型突变体Rac1V12为编码区第12位密码子由甘氨酸变为缬氨酸,一个是显性负调控突变体Rac1N17为编码区第17位密码子苏氨酸变为天冬酰胺酸。重叠区扩增法在生命科学中被广泛应用于构造复合基因,其原理是向PCR产物中掺入一段新的、在原模板内不存在的序列,所需引物只需能与其模板有效结合而不必完全匹配。本研究使用该方法构建Rac1突变体质粒,进而对其在肝细胞EMT中的作用进行初步探讨。方法：①采用Trizo1法从肝细胞L02中提取总RNA,通过逆转录PCR克隆出Rac1cDNA及Rac1基因CDS区DNA序列,并与空载体pEGFP-C1相连构建Rac1野生型质粒pEGFP-C1-Racl。②以cDNA为模板,利用重叠区扩增法通过设计突变引物及三步PCR实现对Rac1基因的定点突变,构建Rac1两突变质粒,持续激活型和显性负调控型。③双酶切验证上述质粒中含有目的基因,DNA测序验证Rac1基因序列和突变点。④使用脂质体法将上述质粒转染入肝细胞L02中。⑤使用荧光显微镜观察荧光蛋白EGFP表达情况及明确转染效率,免疫印迹法判断外源Rac1的表达。⑥用免疫印迹法观察转染质粒48小时后E-钙粘蛋白的表达。结果：成功克隆出Rac1cDNA及580bp左右Rac1CDS序列。将Rac1CDS区成功连接到空质粒pEGFP-Cl中构建pEGFP-Cl-Rac1,双酶切证实有580bp片段及基因测序证实碱基序列正确。成功克隆出含突变点的Rac1上下游片段,上下游片段混合相连后扩增出含突变点的Rac1V12及Rac1N17基因,与空载体相连后经双酶切证实有580bp左右片段及基因测序证实突变点正确,构建成功载体命名为pEGFP-C1-Rac1V12、 pEGFP-C1-Rac1N17。通过脂质体法成功将空载体及以上三颗质粒转染入肝细胞L02中,荧光显微镜下观察到转染效率约为15-22%,免疫印迹法证实转染重组质粒的细胞均有EGFP-Rac1融合蛋白表达。通过持续激活型载体pEGFP-C1-Rac1V12和显性负调控载体pEGFP-C1-Rac1N17分别上调和下调肝细胞Racl活性,发现持续激活型可显著下调E钙粘蛋白表达,显性负调控型能显著增加其表达。结论：重叠区扩增法是一个非常有效的基因改造方法,应用该方法成功进行基因定点突变。成功构建三个重组质粒pEGFP-C1-Rac1, pEGFP-C1-Rac1V12和pEGFP-C1-Rac1N17。Racl有可能通过抑制E钙粘蛋白诱导肝细胞EMT发生。