目的:截至2015年,约有3900万人患有癫痫病。近80%的病例发生在发展中国家。在2015年,它导致125,000人死亡,比1990年的112,000人有所增加。癫痫症在老年人中更为常见。在发达国家,婴儿和老年人中最常发生新病例。在发展中国家,由于潜在原因发生频率的差异,在大龄儿童和年轻人中发病更为普遍。到80岁时,约有5-10%的人会无缘无故发作,再次发作的几率在40%至50%之间。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化L-精氨酸产生一氧化氮(nitric oxide,NO)的一种酶。在中枢神经系统中,一氧化氮合酶具有一系列功能,例如调节睡眠觉醒周期,突触可塑性和激素分泌,也有研究发现,一氧化氮合酶在癫痫动物模型的癫痫活动中其水平升高。NOS家族由三种亚型组成:神经元NOS(nNOS,I型);内皮型NOS(eNOS,III型)和诱导型NOS(iNOS的,II型)。NOS在心脏,脑血管调节,免疫调节和神经系统方面具有非常重要的生物学功能。研究发现,一氧化氮合酶在癫痫动物模型的癫痫活动中其水平升高;在癫痫病史较长的患者中nNOS上调更为明显,这表明nNOS和癫痫有密切联系。在近期研究中,研究者发现nNOS在不同原因引起的癫痫模型以及患者中,产生了不同的表型和作用,例如,NOS抑制剂可以抑制匹罗卡品(Pilocarpine)诱发的急性边缘性癫痫发作,在患有遗传性原发性全身性抽搐性疾病的成年家禽的脑中发现nNOS的活性要比非癫痫的成年家禽高近2倍。但在自发性癫痫大鼠和匹罗卡品诱导的癫痫模型细胞中nNOS如何变化仍不清楚。nNOS的选择性抑制剂应用NOS抑制剂7-硝基吲唑(7-Nitroindole,7-NI)是一种杂环化合物,可通过与L-精氨酸和四氢生物蝶呤竞争而抑制nNOS。也有大量研究表明,抑制nNOS活性是减少NO/NMDA引起的神经毒性,减弱耐受性和撤消对精神活性药物的有益作用。7-NI在研究可作为保护剂,以防止由兴奋性毒性或神经退行性疾病引起的神经损伤。它可以通过减少氧化应激或减少在这些组织中形成的过氧亚硝酸盐的量起作用。在过去的研究中,研究者发现7-NI可以降低动物中nNOS蛋白的表达。在癫痫的研究中,有学者在实验中应用7-NI作为癫痫的辅助药物,但是其具体机制仍然不明确。在过去的研究中,研究者已经证明氧化应激在癫痫中扮演重要角色,同时氧化应激也和癫痫中的炎症有着密切联系,在各种癫痫体内体外模型中,SOD、LDH等指标发生了显著变化,但到目前为止,癫痫氧化应激与nNOS的关系并未阐明。本研究应用Western Blot、细胞培养、免疫荧光和SOD、LDH生化试剂盒揭示了nNOS在癫痫模型中的作用及其毒性机制,揭示一氧化氮合酶可以影响在癫痫模型中的细胞存活率以及氧化应激,为癫痫相关发病机制和抗癫痫药物新靶点的探寻奠定坚实的理论基础以及充分的实验依据。研究方法:1.细胞系培养(N2A、SH-SY5Y细胞系)培养将冻存的细胞种子37℃复苏30分钟,倒入具有培养基的培养皿中,每6-12h观察细胞形态。当细胞充满培养皿时,从培养皿中倒出细胞液,慢慢倒入预热的无血清培养基中,并洗三遍。倒入胰蛋白酶3分钟并且是细胞完全浸在酶中,同时观察细胞的状态。待消化完成,立即倒入含有血清的培养基中,停止消化并将液体转移到新的培养液中。取长好细胞,重复细胞传代过程,消化完全后打入2 mL含血清培养液,将细胞液转移至5 mL EP管中封好,离心后取细胞沉淀与900μL牛血清马血清混悬液和100μL冻存液吹打细胞至均匀,转移至细胞冻存管,4℃30分钟,-20℃2小时,-80℃梯度冻存。2.原代海马神经元培养出生2天内新生Wistar大鼠幼崽,麻醉并断头,快速移出大脑,并将其浸入保持在4度的Hank’s液中。在显微镜冰浴状态下迅速解剖海马,取用冷藏的5 mL细胞培养液(Hyclone DME/F-12)清洗海马组织三次。应用1-2mL果胶酶消化海马组织,轻轻吹打1-2次,移出细胞悬液,并用果胶酶再次消化剩余的组织,直到消化完成。将消化后细胞与海马神经元培养液均匀混合并计数进行铺板。24小时贴壁后每隔一天半数体积换液。培养7-9天观察神经元状态后做实验。3.免疫印迹(Western Blot)实验法取出预先准备好的六孔细胞培养板,向每孔中添加150μL细胞裂解液,然后用细胞刮刀均匀地刮擦培养板,直到细胞与裂解物完全混合。静置30分钟,将细胞裂解液吸入加至1.5毫升的EP管中,在4℃下,使用离心机以12,000rpm的速度分离20分钟,将杂质(例如细胞膜细胞器)离心至试管底部,将其上清液移到新的1.5 mL管中。将样品与上样缓冲液4:1混合,然后将其放在样品加热器中10分钟以使蛋白质变性。电泳后运行凝胶,切换至75 V低压电泳后,切换至110 V 1小时。在玻璃板的底部进行标记电泳以停止电泳并除去凝胶。制作一个转移膜三明治,将其放在冰袋中,在黑暗中将大分子300 mA旋转6小时,然后将小分子200 mA润湿90分钟。封闭膜后,孵育来自兔的VGSC亚基一抗和凋亡相关指数一抗,然后使用TBST洗3次,每一次10分钟。孵育山羊抗兔二抗,每次洗涤TBST 3次,每次10分钟。1:1将ECL发光液体配置好,用为发光。4.CCK8(Cell Counting Kit 8)细胞毒性实验重复细胞传代过程,将悬液接种到96孔板中,每孔种细胞,要混合均匀。至细胞贴壁后,按照浓度梯度给药。每孔加入CCK-8试剂,并继续在培养箱中等待2小时左右,然后用酶标仪进行吸光度测定。CCK8细胞存活率实验通过吸光度值按照细胞存活率(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100%的公式进行计算。5.组织免疫荧光使用腹腔内注射水合氯醛麻醉预处理的大鼠,并向其灌注心脏。首先,注入15ml的生理盐水,然后注入15ml的10%多聚甲醛,直到小鼠的尾巴僵直。之后对大鼠进行断头处理,然后将鼠脑剥出,之后将海马部分剥出,并且用生理盐水进行冲洗。之后,用多聚甲醛将其固定,并在4°C下应用30%蔗糖浸泡过夜,直至其沉入底部,并在摇床上均匀摇晃。第二天将其放在冷冻切片机上,并将切好的脑片平整地放在载玻片上,滴上3%BSA制成的封闭液进行封闭2小时,之后用纸巾或者滤纸吸干。滴下稀释的一抗并将其放在4°C的潮湿箱中过夜,然后第二天用PBST洗涤10分钟,重复三遍,之后均匀滴上荧光二抗和DAPI染色液避光敷两小时,之后用PBST清洗10分钟三次。取出处理过的切片,用甘油覆盖玻片,并通过荧光显微镜拍摄NOS和细胞核的表达。6.细胞免疫荧光培养细胞时每皿铺放一张细胞爬片(WBS),取出处理好的神经元,用4%多聚甲醛固定30分钟,然后用PBS洗涤3次,每次10分钟。用3%BSA封闭溶液封闭30分钟,然后在50μl 4°C湿盒中与300倍稀释的NeuN一级抗体稀释液(Abcam)孵育过夜。第二天,用PBS清洗10分钟,再重复2次,100倍稀释FITC荧光二抗(中杉金桥)50μL敷育两小时。PBS清洗10分钟三次后,DAPI原液染核10分钟,再次重复清洗步骤,取出处理好的细胞爬片,用甘油封片,荧光显微镜拍摄荧光表达情况。7.乳酸脱氢酶(LDH)测试盒、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒和丙二醛(MDA)测定试剂盒检测细胞样品的预处理:先用胰蛋白酶消化细胞,或者用细胞刮刀刮擦细胞,以1000 rpm离心10分钟,并在室温条件下,然后丢弃上清液并保留细胞沉淀。向细胞沉淀中加入0.5-1ml PBS,轻轻上下倒置以混合。在室温下以1000 rpm离心培养液10分钟。丢弃上清液并留下细胞沉淀。然后使用功率为300W的超声细胞破碎器,每次超声3至5秒,间隔30秒,重复4至5次以获得悬浮液。之后,按照说明进行配比。充分混合,在室温下440nm下放置3分钟,用双蒸馏水调节1cm的光直径,并测量每个管的吸光度。使用计算公式进行计算。8.统计分析根据免疫印迹实验分别将其PVDF膜成像灰度值转换成标准化比值。应用GraphPad 7.0软件绘制对照组,匹罗卡品模型组,NOS抑制剂加药模型组和NOS抑制剂加药组,使用ImageJ计算免疫荧光的光密度值。使用SPSS软件评估数据的差异的意义,统计方法主要为t检验和方差分析,数据为平均值±标准差,P<0.05认为具有统计学差异,P<0.01认为具有显著性统计学差异。结果:1.nNOS在自发性癫痫大鼠的海马中的表达和定位应用免疫印迹技术对自发性癫痫大鼠和普通Wistar大鼠的海马蛋白进行对比,发现NOS蛋白在癫痫模型大鼠中表达增加。对成年大鼠(1年)进行NOS蛋白的荧光定位,我们发现NOS集中表现在CA1,CA3区域,幼年大鼠(4个月)中,我们发CA1,CA2区域中的NOS表达量更多,同时在DG区也NOS的表达也明显增加。2.nNOS在癫痫神经细胞模型中的表达与定位应用匹罗卡品进行建立体外癫痫模型,发现匹罗卡品诱导的癫痫模型神经元组的NOS蛋白表达有明显的上调。我们对Neuro-2A细胞进行同样的匹罗卡品诱导方式,发现结果相似。利用CCK8实验进行细胞存活率检测,测得经过给予匹罗卡品24小时之后,发现N2A细胞有明显的死亡。进一步应用免疫荧光技术,发现nNOS在海马神经元和N2A细胞中的定位和表达,发现与正常细胞相比,nNOS在细胞癫痫模型中表达量明显增加。3.NOS抑制剂对癫痫细胞模型中nNOS表达的影响应用CCK8对N2A和SH-SY5Y细胞进行nNOS浓度梯度的WST-8的细胞存活率检测,应用7-NI按照0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μM的浓度梯度给药24小时后进行浓度效应曲线测定,我们发现在100μM浓度下的7-NI是不影响存活率的最高浓度。进一步应用Western Blot对细胞蛋白进行检测,发现100μM 7-NI能够有效减少癫痫细胞模型中nNOS的表达,同时发现在对照组中,100μM 7-NI并不能减少nNOS蛋白的表达。4.NOS抑制剂对癫痫细胞模型中细胞存活率的影响应用CCK8观察100μM 7-NI对匹罗卡品癫痫细胞模型所造成的细胞死亡的影响。在所得到的结果中发现,100μM 7-NI可以有效减少由于癫痫所造成的细胞死亡。5.NOS抑制剂可以减少癫痫细胞模型中氧化应激指标应用SOD、LDH生化试剂盒对对照组、癫痫模型细胞组、给药癫痫模型细胞组和给药对照组的N2A细胞进行检测,发现一氧化氮合酶抑制剂100μM 7-NI减少在癫痫模型中SOD和LDH的活性。结论:与Wistar大鼠相比,自发性癫痫大鼠的海马nNOS蛋白表达上调;与正常对照神经细胞相比,匹罗卡品诱导癫痫细胞模型nNOS表达量上调。NOS抑制剂7-NI可减少匹罗卡品诱导癫痫细胞模型nNOS蛋白的表达。NOS抑制剂7-NI增加匹罗卡品诱导癫痫细胞模型的细胞存活率。NOS抑制剂7-NI减少匹罗卡品诱导癫痫细胞模型的氧化应激。通过我们的研究证明,在癫痫体内模型和体外模型中,nNOS的表达上调,我们通过抑制NOS发现,抑制NOS可以减少由癫痫造成的细胞死亡以及由癫痫引起的氧化应激损伤,为离子通道相关神经系统疾病如癫痫的发病机制以及抗癫痫药物新靶点的探寻奠定坚实的理论基础和实验依据。