目的:Hippo信号通路是在果蝇身上发现控制器官大小的重要信号通路,yap蛋白是其中重要核心组件。组织器官对外界机械张力转化为生物化学分子效应与Hippo信号通路密切相关。创面愈合及瘢痕形成涉及一系列复杂生物细胞学过程,增生性瘢痕的发生与多方面因素相关,如性别、年龄、体质、感染等,病理上表现则是成纤维细胞大量增殖及细胞外基质沉淀,yap蛋白与成纤维细胞感受瘢痕压力、增殖及生长因子的分泌密切相关。本实验拟通过观察兔耳创面愈合至增生性瘢痕形成这一过程中yap蛋白的表达、分布及变化,探讨yap蛋白在创面修复及瘢痕增生中的作用,为瘢痕的形成提供分子水平的理论依据,为瘢痕治疗提供新的思路方法及治疗靶点。方法:选取10只新西兰大耳白兔(由泸州医学院动物实验中心中心提供),雌雄不限,体重平均2.5-3.0Kg。将每只兔子左耳设定为A组,右耳设定为B组,A组每只大耳兔用打孔器在左耳打3个直径0.6cm圆形全层皮损至软骨,并彻底破坏软骨膜,热凝止血;B组每只大耳兔耳用打孔器打3个直径1cm圆形全层皮损至软骨,彻底破坏软骨膜,热凝止血,每个创面间隔>1cm。其后,每只兔子饲养条件相同,7天后祛除痂壳。14天时取靠近头部创面;30天时取兔耳中间创面;60天取剩下创面。将所取标本置于10%中性福尔马林中固定12小时,常规梯度酒精脱水,浸蜡包埋切片,做免疫组化组织学染色。yap蛋白免疫组化染色阳性信号为棕黄色颗粒。yap图像分析方法:1、在400倍显微镜下分别观察各切片中表皮及表皮下细胞中yap阳性颗粒个数,并计算。每张切片观察5个视野取其均数进行比较。2、用image-pro6.0图像分析软件系统,将yap的表达强度用iod值表示,每张切片取5个视野,分别测定每个视野的iod值并取其均数作为该标本的iod值,进行比较。结果:一、新西兰大耳白兔瘢痕造模成功率:a组造模出24个合格瘢痕,成功率为80%,b组造模出27个合格瘢痕,成功率为90%(模型成功标准:肉眼可见明显创面组织增生、质硬,瘢痕表面较周围正常组织高出2mm);二、显微镜下yap免疫组化染色结果:1、14天时,a组及b组创面周围组织向创面中心回缩,大部分创面干燥,显微镜下创面肉芽组织、炎性细胞及毛细血管增生,表皮细胞中yap蛋白主要表达于细胞质,表现为细胞质中可见细小棕黄色颗粒,此期成纤维细胞数量少,棕黄色颗粒少数发现于细胞核中;2、30天时,肉眼观察,创面愈合且瘢痕增生明显,增生瘢痕色红、质硬,瘢痕中心高于周围皮面,b组较a组瘢痕增生明显,纤维镜下看,瘢痕表面为薄层表皮细胞并伴角化,正常皮肤附件如毛囊、皮脂腺等缺乏,瘢痕下,部分成纤维细胞生成,呈梭形并排列整齐,棕黄色颗粒出现于成纤维细胞核,细胞质棕黄色淡染;3、60天时,肉眼观察,a组部分模型瘢痕较30天缩小,其余个别瘢痕较30天垂直直径增大,且硬度增加,显微镜下看,瘢痕表皮下大量成纤维细胞生成,成纤维细胞呈梭形并排列整齐,b组部分瘢痕成纤维细胞排列紊乱,漩涡状排列形成,个别瘢痕可见玻璃样变。4、70-90天观察,肉眼见瘢痕缩小,纤维镜下看,成纤维细胞减少,部分正常细胞结构消失玻璃样变。三、数据统计学分析:1、14天时,b组在阳性颗粒数、积分光密度、平均光密度数值上均高于a组,且p<0.05,差异具有统计学意义;2、30天时,b组在在阳性颗粒数高于a组,p>0.05,差异不具有统计学意义,积分光密度、平均光密度数值上均高于a组,且p<0.05,差异具有统计学意义;3、60天时,b组在在阳性颗粒数高于a组,p>0.05,差异不具有统计学意义,积分光密度、平均光密度数值上均高于a组,且p<0.05,差异具有统计学意义;4、阳性颗粒数a组第14天:22.38±5.12,第30天:34.88±3.56,第60天:32.38±5.82,30天与60天数值均高于14天,p<0.05,差异具有统计学意义,60天数值小于30天,p>0.05,差异不具有统计学意义;b组第14天:35.13±6.12,第30天:39.63±5.68,第60天;34.50±2.4430天数值高于14天及60天,p>0.05,差异不具有统计学意义,60天数值小于30天,p>0.05,差异不具有统计学意义;5、平均光密度a组第14天:0.20±0.01,第30天:0.24±0.03,第60天:0.22±0.06,30天数值大于14天,p<0.05,差异具有统计学意义,30天数值大于60天,p>0.05,差异不具有统计学意义;b组第14天:0.22±0.01,第30天:0.30±0.04,第60天:0.31±0.02,30天大于14天,p<0.05,差异具有统计学意义,30天小于60天数值,p>0.05,差异不具有统计学意义;6、积分光密度a组第14天:1016.63±90.07,第30天:1368.00±169.01,第60天:1355.13±162.87,30天与60天数值均大于14天,且P<0.05,差异具有统计学意义,30天数值大于60天,P>0.05,差异不具有统计学意义;B组第14天:1358.38±186.57,第30天:1921.75±100.76,第60天:1911.88±114.00,30天与60天数值高于14天,P<0.05,差异具有统计学意义,60天数值小于30天,P>0.05,差异不具有统计学意义。结论:1、瘢痕表皮细胞中yap主要表达于细胞质中;2、成纤维细胞细胞质与细胞核均可见yap蛋白的表达,但在瘢痕增生期间主要表达于细胞核中;3、yap蛋白的表达与创面面积大小呈正相关,创面面积越大,愈合后瘢痕中yap蛋白表达越多;4、yap蛋白不是持续贯穿表达于创面愈合致瘢痕退缩期间,当瘢痕开始萎缩时,yap蛋白表达减少。