在全球范围内，胃癌是癌症相关的死亡率第二位的癌症。它在亚洲的发病率高于其他地区。在我国，胃癌在恶性肿瘤中死亡率第二，发病率占第三。由于胃癌通常在癌症晚期或因转移性胃癌被发现，所以预后一般较差，5年生存率小于30%。外科手术是目前最有效的治疗策略，但大约50-70%进展期胃癌病人术后出现复发。因此，化疗已被广泛应用于手术后的患者及晚期胃癌姑息性治疗，以提高患者的生活质量和延长生存期。尽管胃癌被认为是对化疗不敏感的癌症之一，但铂类及氟尿嘧啶类药物仍为胃癌化疗一线方案，其中几种重要的化疗药物如顺铂（cisplatin, DDP）和5-氟尿嘧啶（cisplatin,5-FU）的治疗胃癌还是作为一线药物有一定效果，但是生存时间一直不理想。多种证据表明，由于多药耐药（multidrug resistance, MDR）的发生导致了长期化疗不能消除所有癌细胞，进而造成癌症复发。膜联蛋白家族属于Ca(2+)调节的磷脂和膜结合蛋白，家族成员膜联蛋白A2(ANXA2)参与了细胞骨架重排。在肿瘤的形成、增殖、凋亡和信号转导形成过程中都扮演重要角色。然而，ANXA2在不同肿瘤中的表达模式不同，提示ANXA2在不同肿瘤发生发展中可能起不同作用。如在肝脏和乳腺组织中表达上调，而在前列腺和食管癌组织中表达下调。ANXA2可以作为肿瘤治疗的靶标以及肿瘤的形成、增殖、凋亡和信号转导及判断患者预后的生物标志。然而，ANXA2在胃癌中的表达和功能仍不十分清楚。目的：本研究以临床切除的胃癌组织及胃癌细胞系为研究对象，观察ANXA2在胃癌中的表达及其在胃癌耐药细胞中的作用机制。以阐明ANXA2在胃癌发生发展过程中的重要作用，为胃癌的靶向治疗提供理论依据。方法：通过实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法观察ANXA2在胃癌和癌旁组织及不同分化程度的胃癌及胃癌细胞耐药株中的表达，通过RNA干扰封闭ANXA2表达，观察ANXA2对胃癌耐药细胞SGC7901/DDP细胞药物敏感性、耐药基因表达及信号通路激活的影响，结果：本课题五部分的具体结果内容如下：第一部分胃癌组织中ANXA2的表达研究第一部分实验主要利用荧光定量RT-PCR和Western blot方法观察ANXA2在临床切除的胃癌标本和癌旁组织中的表达情况。结果如下：1ANXA2在胃癌组织和癌旁组织中转录水平的差异应用荧光定量RT-PCR方法检测了所有临床切除的胃癌样本及癌旁对照组织中ANXA2的mRNA表达。结果显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中ANXA2的mRNA表达水平明显升高。结果表明，ANXA2在胃癌发生过程中转录水平发生改变，ANXA2在胃癌发生过程中可能发挥重要作用。2ANXA2在胃癌组织和癌旁组织中翻译水平的差异为了明确ANXA2与胃癌发生的关系，我们进一步通过Western blot观察了胃癌组织和癌旁组织中ANXA2蛋白水平，结果显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中ANXA2的蛋白表达水平明显升高。结果表明，ANXA2在胃癌发生过程中翻译水平发生改变，ANXA2在胃癌发生过程中可能发挥重要作用。第二部分不同分化程度胃癌的ANXA2表达的研究第二部分实验主要利用荧光定量RT-PCR和Western blot方法观察ANXA2在临床切除的不同分化程度胃癌标本和不同分化的胃癌细胞株中的表达情况，以初步探讨ANXA2胃癌癌分化中的意义。结果如下：1ANXA2基因在不同分化胃癌组织中的表达为了明确ANXA2与胃癌发生的关系，我们进一步观察了ANXA2基因表达与胃癌分化程度的相关性。我们通过荧光定量PCR和western blot对高、中和低分化胃癌组织中ANXA2进行检测，结果显示，胃癌组织分化程度越高ANXA2的mRNA和蛋白表达越低。结果表明，Annexin A3基因表达与胃癌细胞株分化程度呈负相关。2ANXA2基因在不同分化胃癌细胞株中的表达为了进行体外机制研究，我们接着检测了不同分化程度的胃癌细胞株中ANXA2的表达。我们通过荧光定量PCR和western blot对不同程度胃癌细胞株中ANXA2的表达进行检测，结果显示，ANXA2的表达由低到高为：高分化腺癌细胞株MKN-28、中分化腺癌细胞株SGC-7901、低分化腺癌细胞株BGC-823。结果表明，Annexin A3基因表达与胃癌细胞株分化程度呈负相关。第三部分ANXA2-siRNA转染对胃癌细胞株耐药性的影响第三部分实验主要利用荧光定量RT-PCR和Western blot方法观察ANXA2在胃癌细胞及胃癌耐药细胞中的表达情况，及封闭ANXA2（小干扰RNA技术）表达后胃癌细胞耐药性的改变，以阐ANXA2在胃癌细胞耐药中的作用机制。结果如下：1胃癌耐药细胞中ANXA2mRNA和蛋白的表达情况我们首先检测了DDP耐药细胞SGC7901/DDP及其对照细胞SGC790的IC50值，MTT结果显示，SGC7901/DDP细胞对DDP的IC50值为5.36±0.73μg/ml，而对照细胞SGC7901为0.26±0.03μg/ml。我们进一步检测了ANXA2mRNA在胃癌耐药细胞中的表达，荧光定量RT-PCR分析结果显示：DDP耐药细胞SGC7901/DDP中ANXA2的mRNA表达水平明显高于对照细胞SGC7901中ANXA2的表达。我们同样检测了ANXA2蛋白在胃癌耐药SGC7901/DDP细胞中的表达，Western blot分析结果显示：DDP耐药细胞SGC7901/DDP中ANXA2的蛋白表达水平明显高于对照细胞SGC7901中ANXA2的表达。2ANXA2-siRNAs对SGC7901/DDP细胞ANXA2表达的影响为了进一步阐明ANXA2表达对胃癌细胞耐药的影响，我们采用ANXA2-siRNAs转染高表达ANXA2因子的SGC7901/DDP胃癌耐药细胞，同时以转染control-siRNA细胞作为阴性对照，观察ANXA2-siRNA对SGC7901/DDP细胞ANXA2表达的影响。荧光定量RT-PCR和Western blot结果显示，不同浓度（20、40和80nM）的ANXA2-siRNAs转染SGC7901/DDP细胞48h后，ANXA2的mRNA和蛋白表达均有不同程度下降，其中80nM浓度ANXA2-siRNAs对ANXA2的敲低作用达到了90%以上。而细胞转染control-siRNA后ANXA2表达没有明显改变。我们进一步检测了不同时间（24,48或72h）ANXA2-siRNAs转染SGC7901/DDP细胞对ANXA2mRNA和蛋白表达的影响。荧光定量RT-PCR结果和Western blot结果显示，80nM的ANXA2-siRNAs转染SGC7901/DDP细胞24,48或72h后，ANXA2的mRNA和蛋白表达逐渐降低，相比于转染control-siRNA对照，其中48h及72h时ANXA2mRNA和蛋白表达均下降了90%以上。以上结果表明，实验所用ANXA2-siRNAs的能高效、特异、持久抑制内源性ANXA2表达。3ANXA2-siRNAs转染对SGC7901/DDP细胞耐药的影响我们进一步研究了ANXA2-siRNAs转染对SGC7901/DDP细胞耐药的影响。MTT实验结果显示，与转染control-siRNA对照相比，80nM浓度ANXA2-siRNAs转染48h后，SGC7901/DDP细胞对doxorubicin,5-fluorouracil及cisplatin IC50值明显降低，结果表明，ANXA2-siRNAs可提高SGC7901/DDP细胞对化疗药物的敏感性。第四部分ANXA2-siRNA转染对胃癌细胞耐药相关基因表达的影响第四部分实验主要利用小干扰RNA技术，通过荧光定量RT-PCR和Western blot方法观察抑制内源性ANXA2后，观察胃癌耐药SGC7901/DDP细胞多药耐药因子表达的影响。结果如下：1ANXA2-siRNAs转染对耐药相关基因mRNA表达的影响为进一步阐明ANXA2在胃癌多药耐药中的作用，我们采用荧光定量RT-PCR的方法检测了耐药相关基因mRNA的表达情况，结果显示：与对照组相比，80nM的ANXA2-siRNAs转染48h后，SGC7901/DDP细胞中经典耐药途径中耐药相关基因P-gp、MRP1和Bcl-2的mRNA表达水平均明显降低，而Bax则显著升高。但是其他的几个非经典耐药途径中耐药相关因子GST-π、TOPO-I和TOPO-II的mRNA表达并没有明显的变化。2ANXA2-siRNAs转染对耐药相关基因蛋白表达的影响我们同时检测了ANXA2-siRNAs转染后耐药相关基因蛋白的表达变化。Western-blot检测结果显示：与对照组相比，80nM的ANXA2-siRNAs转染48h后，SGC7901/DDP细胞中经典耐药途径中耐药相关基因P-gp、MRP1和Bcl-2的蛋白表达水平均明显降低，而Bax则显著升高。但非经典耐药途径中耐药相关因子GST-π、TOPO-I和TOPO-II的蛋白表达并没有明显的变化。这与mRNA的检测结果一致。第五部分ANXA2-siRNA转染对胃癌耐药细胞MAPK及PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响第五部分实验进一步应用RNA干扰技术特异性抑制内源性ANXA2表达，应用Western blot观察SGC7901/DDP细胞中MAPK信号转导通路和PI3K/AKT通路活化情况，以阐明ANXA2在胃癌细胞耐药形成中的作用机制。结果显示，80nM的ANXA2-siRNAs转染SGC7901/DDP细胞48h后，MAPK信号通路分子AKT、P38和JNK蛋白表达均无明显变化，但AKT和P38的磷酸化水平明显下降。结论：综合上述五部分内容，本研究得出如下结论：1ANXA2在胃癌组织中高表达，且与肿瘤分化程度关系密切，提示ANXA2在胃癌形成过程中可能发挥了重要作用。2ANXA2的表达与胃癌细胞耐药有关，抑制内源性ANXA2表达后胃癌耐药细胞株的药敏性增强，这与ANXA2调节P-gp、MRP1和Bcl-2等多药耐药相关基因有关，3抑制内源性ANXA2表达后胃癌耐药细胞株AKT和p38的磷酸化水平明显下降，表明AKT和p38的磷酸化过程可能参与ANXA2对胃癌细胞耐药的形成。