【摘 要】
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维生素C是人体生命活动不可或缺的维生素,且广泛应用于食品、化妆品、医药和饲料等诸多行业。目前工业生产维生素C（Vc）的主要方法是“二步发酵法”,其中第二步以L-山梨糖为原料,利用产酸菌和伴生菌混合发酵生产Vc的前体物质2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。发酵过程中的产酸菌为普通生酮基古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare,K.vulgare,K.v）,单独培养时生长弱产酸低,但
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维生素C是人体生命活动不可或缺的维生素,且广泛应用于食品、化妆品、医药和饲料等诸多行业。目前工业生产维生素C（Vc）的主要方法是“二步发酵法”,其中第二步以L-山梨糖为原料,利用产酸菌和伴生菌混合发酵生产Vc的前体物质2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。发酵过程中的产酸菌为普通生酮基古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare,K.vulgare,K.v）,单独培养时生长弱产酸低,但是能够将L-山梨糖转化为2-KLG;伴生菌多为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）,不具备产酸能力,在生长末期和营养物质匮乏情况下能够产生芽孢。有研究表明伴生菌的产孢对产酸菌的生长和产酸至关重要,本论文在此基础上,选择伴生能力有一定差异两株伴生菌,通过分析两株伴生菌在混菌发酵中产孢过程相对于单菌培养的变化情况以及该过程对产酸菌生长和产酸的影响,深入研究伴生菌的产孢过程对产酸菌的影响,为两菌间互作机制的研究提供新的方向。主要研究结果如下:（1）K.v 25B-1在单菌发酵时,生长弱且产酸能力低,在与伴生菌混菌发酵时,生长状态和产酸量有明显提高,其中三种不同混菌发酵体系2-KLG的产量为:B.s+K.v:78.43±0.79 mg/m L;B.e+K.v:69.71±1.26 mg/m L;B.p+K.v:71.88±1.12 mg/m L,选择伴生能力存在一定差异的两株伴生菌:枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis A9,B.subtilis A9,B.s A9）和内生芽孢杆菌（Bacillus endophyticus ST-1,B.endophyticus ST-1,B.e ST-1）。在混菌发酵体系中,产酸菌促进了B.s A9和B.e ST-1生长和产孢。K.v 25B-1单菌发酵时,发酵液p H偏酸性,而混菌发酵中B.s A9和B.e ST-1能够中和2-KLG的酸性,为K.v25B-1提供适宜生长和产酸的微环境。K.v 25B-1单菌发酵中,发酵液ORP维持在-57m V～26 m V之间,随着发酵时间的增加,ORP逐渐升高,发酵液呈氧化性;B.s A9和B.e ST-1能够降低发酵液的ORP值,使发酵液呈现还原性,更有利于产酸菌生长。（2）混菌发酵体系中,B.s A9和B.e ST-1产孢时间提前,且芽孢数量升高。培养12 h、24 h、36 h和48 h的B.s A9和B.e ST-1胞外液均能够促进K.v 25B-1的产酸,其中48 h的胞外液促进效果最好。在混菌发酵体系中,K.v 25B-1产酸相关酶SDH、SNDH的活力均高于单菌发酵体系,随着伴生菌芽孢的大量产生,酶活力升高并在48 h达到最高值,同时,随着伴生菌芽孢的产生,K.v 25B-1活菌数逐渐升高,发酵体系中的2-KLG产生速率加快。（3）混菌发酵中,B.s A9群体感应基因lux S及信号肽基因phr C、phr A表达量在12 h显著升高,推测此时信号分子AI-2及信号肽Phr A、CSF可能大量产生,从而促进了产孢相关蛋白Spo0A的磷酸化,同时,产孢相关基因spo0A、spo0F、spo VFA的大量表达提前可能导致Spo0A含量和磷酸化水平的提高,从而使B.s A9产孢时间提前。伴生菌的产孢诱导了K.v 25B-1中DNA复制起始相关基因dna G、dna B和产酸酶基因sdh、sndh的大量表达,促进了产酸菌生长繁殖和SDH、SNDH酶活力升高,使发酵体系中的2-KLG大量积累。
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