论文部分内容阅读
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）是专性细胞内寄生的病原微生物,具有独特的双相发育周期即有感染性、小而致密的原体（elementary body,EB）和无感染性、大而疏松的网状体（reticulate body,RB）,二者复制所在的液泡称为包涵体。包涵体膜蛋白（inclusion membrane proteins,Inc蛋白）是衣原体编码的III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）效应蛋白,经由T3SS转运并插入包涵体膜后对包涵体进行广泛修饰。这些效应蛋白有助于包涵体膜的稳定,促进宿主与衣原体的相互作用,参与调节宿主信号通路和细胞功能。已有研究表明Inc蛋白在衣原体生长发育等多个方面具有重要作用,引起研究者高度关注。CT225是已经经实验证明的Inc蛋白,但其生物学功能有待研究。前期运用LC-MS/MS液质联用质谱技术筛选出与CT225互作的候选蛋白-波形蛋白（Vimentin,VIM）,并进行初步鉴定,但仍需进一步探究。因此,本研究利用蛋白建模及分子对接软件、酶联免疫吸附测定技术对二者相互作用的分子机制做进一步鉴定。首先检索文献得到VIM结构域（N端头部结构域、中心杆部结构域和C端尾部结构域）所在区域的基因序列,分别为VIM1-101、VIM102-410和VIM411-466。再根据蛋白质序列,使用从头预测蛋白质的方法利用Rosetta在线服务器构建CT225和VIM的三维结构模型,并使用GROMACS软件进行分子动力学优化。然后经PROCHECK程序对两个模型进行Ramachandran plot（拉氏图）分析和数据分析,结果显示两种蛋白质98.0%以上的残基都在允许范围,表明建立的两种模型都足够可靠。使用ZDOCK 3.2在线软件建立CT225-VIM复合物的对接模型,根据软件说明选取分值最高的复合物模型进行分析。最后使用PDBe PISA在线服务器分析CT225-VIM对接复合物中氢键和盐桥的成键距离,预测二者相互作用的氨基酸残基。结果显示,CT225的7个残基（ASN3、GLU81、ASP122、VAL1、ASP73、GLN74、LYS80）和VIM1-101、VIM102-410的6个残基（ARG13、TYR30、ARG12、SER25、ARG28、GLU349）是参与两种蛋白相互作用的热点,从而预测CT225可能与VIM1-101和VIM102-410结构域相互作用。其次,根据VIM结构域所在区域的基因序列,以实验室保存的pc MV-flag-VIM重组质粒为模板,由公司合成VIM三个结构域基因片段,重组得到pSmart-I-SUMO-VIM1-101、pSmart-I-SUMO-VIM102-410和pSmart-I-SUMO-VIM411-466质粒。同时使用同源重组的方法,重组得到p ET28a-His-VIM质粒。将含有重组质粒的菌液扩大培养,经诱导表达、超声破菌及Ni Sepharose FF亲和层析纯化,利用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行蛋白检测,冻存备用。最后利用酶联免疫吸附技术验证CT225与VIM的互作区域。通过包被SUMO-VIM1-101、SUMO-VIM102-410、SUMO-VIM411-466和His-VIM融合蛋白,加入GST-CT225融合蛋白孵育,兔抗GST抗体作为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗,经TMB显色反应和测定450nm处的吸光度值,显示CT225蛋白与VIM1-101、VIM102-410、VIM存在相互作用,结果与生物信息学预期相符。综合以上实验结果,进一步证实了CT225与VIM1-101结构域、VIM102-410结构域的相互作用,为CT225生物学功能的进一步研究提供了依据。