油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)是植物内源合成的一类重要的生长促进型甾醇类激素,参与到植物生长发育的各个方面,包括细胞伸长、维管组织分化、开花、衰老、抗逆、抗病等。其信号传导途径近年来在双子叶模式植物拟南芥中取得了快速进展,并已有了比较完整的认识,然而在单子叶模式植物水稻中,其相关的研究还很零散。目前相关植物突变体和转基因工作均已显示出BR在提高植物产量中的巨大应用潜力,因此在重要的粮食作物水稻中开展有关BR信号传导及下游功能机制的研究具有重要的理论和应用意义。　　 通过对本研究组构建的水稻突变体库进行筛选,获得一个半矮化少分蘖突变体(dwarf and low-tillering,dlt),表现出典型的BR温和突变体的多向性表型,包括矮化深绿、叶片短而宽厚、叶夹角变小、株型紧凑、第二茎节特异性缩短等。对突变基因进行图位克隆发现DLT编码植物特异的GRAS蛋白家族中的一员,突变体在此基因内部含有62bp缺失。将野生型DLT基因导入突变体中能完全互补突变体的表型,对野生型DLT进行RNA干涉得到和突变体类似的表型,而过表达DLT则引起和突变体完全相反的表型,这些转基因实验充分证明DLT控制着突变体的诸多表型。叶夹角和胚芽鞘对活性BR(Brassinolide,BL)的敏感性实验证明,dlt是一个BR不敏感的突变体。定量RT-PCR分析发现BR合成基因及DLT自身的转录水平在突变体中都明显升高,而且外源施加BL对这些基因表达的抑制程度在突变体中都明显减弱,同时突变体中多个BR响应基因的表达水平都有所变化。进一步对DLT启动子的分析发现了三个BR反应元件,并在体外用凝胶阻滞实验证明了OsBZR1能够结合此元件,说明DLT可能在转录水平上受OsBZR1直接调控,从而介导BR的信号传导过程。　　 DLT蛋白定位在细胞核中,对DLT的蛋白序列进行分析发现有多达16处的GSK3类激酶的磷酸化位点,暗示DLT可能在蛋白水平受一个水稻中未知的OsBIN2的磷酸化修饰调节。于是我们对一个和拟南芥BIN2同源的基因(OsBIN2)进行了干涉和过表达等转基因实验。过表达植株大部分都具有类似于d61-4和brd1严重BR缺陷突变体的表型:极端矮化深绿、叶鞘叶片缩短直立、种子变小、开花延迟等,而干涉株系则具有相反的表型,最明显的是叶夹角的增大,并且BR合成基因及DLT的转录水平在过表达株系中上调,而在干涉株系中下调,这些结果表明OsBIN2具有和拟南芥的BIN2保守的功能,在BR信号传导途径中起着关键的负调控作用。同时过表达DLT和OsBIN2的转基因植株并没有表现出单独过表达OsBIN2植株引起的严重表型,而是与单独过表达DLT的表型类似,证明了DLT位于OsBIN2下游。体外磷酸化实验和酵母双杂交证实OsBIN2能够和DLT相互作用并将其磷酸化。在植物体内,DLT蛋白能够被BL诱导,并且在BR突变体以及OsBIN2转基因株系中发现DLT蛋白水平以及磷酸化状态均发生了改变,尤其是在OsBIN2的过表达株系中,高度磷酸化的DLT蛋白非常显著的积累,充分证明OsBIN2在体内能直接对DLT进行磷酸化修饰。　　 综上所述,我们通过正向遗传学和反向遗传学方法分别鉴定了两个水稻中重要的BR信号传导分子DLT和OsBIN2,并深入研究了其相互作用及功能机制。在转录水平上DLT可能受OsBZR1的直接调控,而在蛋白水平上DLT受OsBIN2的直接磷酸化修饰所调控,从而形成一个复杂的BR信号传导网络介导下游BR反应。这些结果结合拟南芥中的数据暗示了一种全新的BR作用机制,即BR利用多个OsBIN2的底物来放大上游信号,从而行使其非常广泛的功能。此外,我们的研究促进了对水稻中激素响应机制的揭示,并为利用BR改善植物株型及提高作物产量提供了理论依据。