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野生橘在柑橘的起源和进化中起着重要作用,并且具有良好的环境适应性和潜在的抗性,是柑橘重要的种质资源。柑橘胚性愈伤组织不仅是进行柑橘种质资源离体保存的主要形式,而且在柑橘品种的遗传改良中也起着十分重要的作用。它是进行体细胞融合创造新种质必不可少的材料,也是进行转基因操作改良品种的主要受体。体胚发生是植物由体细胞实现植株再生的必经途径,而不同品种(系)之间的胚性愈伤组织的胚性能力存在着差异。本研究利用野生柑橘、地方良种、主栽品种及柑橘的近缘属植物共50份成熟果实的未发育胚珠为材料,进行了柑橘胚性愈伤组织诱导；在柑橘胚性愈伤组织中克隆了LEAFY COTYLEDON1-LIKE(CsL1L)基因并进行了分析,主要研究结果如下:
1.成功地诱导和保存了38份包括野生橘在内的胚性愈伤组织,极大地丰富了柑橘离体保存种质资源库。在诱导过程中观察发现,绝大多数基因型的胚性愈伤组织是通过未发育胚珠-胚状体-胚性愈伤组织的途径而产生的,其中甜橙类品种的未发育胚珠具有较强的胚胎发生能力；
2.对三种野生柑橘,即莽山野橘(Citrus mangshanensis)、道县野橘(C.daoxianensis)和崇义野橘(C.reticulata Blanco)的胚性愈伤组织进行了胚性能力测定和再生实验。结果显示,三种野生柑橘胚性愈伤组织的胚性能力具有显著性差异,并且都能通过体胚发生途经实现植株再生；
3.在伏令夏橙胚性愈伤组织中克隆了CsL1L(LEAFY COTYLEDON1-LIKE of C.sinensis)基因,其全长为818bp,编码238个氨基酸,其推导的蛋白质的等电点为6.72,分子量为26.47 kD。与其它物种中L1L基因的序列比对和同源性分析发现,CsLIL含有转录因子HAP3中LEC1类亚基特有的氨基酸,序列同源性在50％(胡萝卜的LEC1基因,C-LEC1)-86％(拟南芥的LEC1-LIKE基因,AtL1L)之间,其中与CCAAT-box结合的结构域高度保守；进化分析结果表明,CsL1L与拟南芥中L1L(AtL1L)基因的进化关系较近；CsL1L蛋白含有4个α螺旋,与HAP3中LEC1蛋白结构相似。以上分析结果表明,本研究克隆的CsL1L可能是拟南芥中与CCAAT-box结合的HAP3中LEC1类亚基的同源基因；
4.通过半定量和实时定量RT-PCR结果发现,CsL1L主要在胚性器官和组织如种子、胚性愈伤组织以及不同发育阶段的体胚中表达,其中在心形和鱼雷形胚中表达量最高,而在营养器官及非胚性愈伤组织中几乎不表达；mRNA原位杂交结果也发现,CsL1L主要在胚性细胞、球形胚的形成层和子叶胚的维管束细胞中表达,而在非胚性细胞中不表达。CsL1L的表达模式与拟南芥的AtLEC1、向日葵的HaL1L以及可可的TcL1L的表达模式一致,而后三个基因已经被证实在体胚发生早期及在胚胎发育过程中都起着重要作用。根据以上结果我们可以推测,CsL1L也可能在体胚发生早期和胚胎发育过程中起重要作用。亚细胞定位结果显示,CsL1L主要在细胞核表达,这说明CsL1L蛋白是一个核蛋白。
5.通过Southern杂交研究了CsL1L在不同柑橘品种基因组中的拷贝数。结果显示,CsL1L三在凤凰柚、枳和清见中以单拷贝形式存在；而在葡萄柚、本地早、伏令夏橙、尤力克柠檬、酸橙、宜昌橙、红橘和枸橼中则以一个或两个拷贝的形式存在。以上结果说明,CsL1L在不同品种的柑橘基因组中的拷贝数不同,为一个或两个拷贝。
6.CsL1L基因中存在一个具有三个核苷酸重复的SSR位点。利用这个位点开发出的SSR标记经PAGE电泳结果显示,该位点在柑橘的不同种/属和品种中具有丰富的多态性。根据这个具有丰富的多态性的位点,我们可以对柑橘进行杂种鉴定、并且可以与其它标记一起用作遗传图谱构建和系谱分析。
另外,我们以开放性授粉的三倍体BHR(本地早×[哈姆林+粗柠檬])为材料进行愈伤组织诱导时发现,三倍体BHR的成熟果实中有少量种子存在并对其进行了胚培养和再生植株的分析。结果显示,BHR的后代中出现了二倍体、三倍体、四倍体和非整倍体的倍性分离。根据分子鉴定和形态观察的结果,再结合双受精的胚乳平衡数(EBN)和种子中胚乳与胚的比例理论,我们推测三倍体可能来源于柑橘珠心细胞的无融合生殖,而二倍体可能来源于由三倍体产生的单倍体配子与外界花粉的杂交。