重阳木丛枝病植原体的分子鉴定及与其它几种植原体的相关性研究

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重阳木是我国南方重要的阔叶树种之一,丛枝病在我国重阳木栽种区发生普遍,表现为植株叶片变小、黄化或变红、枝条节间缩短、侧芽过度生长,导致丛枝、衰退、梢枯,严重时整株枯死。已有研究表明重阳木丛枝病(BiWB)是由植原体(原称为类菌原体)引起的,目前此病害仅在我国有报道。由于病原分子生物学研究信息缺乏而未能被鉴定和系统归类。本研究用分子生物学方法对我国不同地区BiWB植原体进行鉴定,并运用新的分类方法对其进行了分类。扩增、克隆并测定了该植原体的浙江、安徽和江西分离物16S rRNA基因、23S rRNA基因、延伸因子(tuf)基因、核糖体蛋白(rp)基因及16S-23SrDNA间区(SR)等相对保守序列,将得到的序列与GenBank上已公布的植原体相应基因的序列进行比较,最终确定了三个地区的BiWB由单一病原侵染所致,未发现与其它组植原体混合感染的现象。结果显示,BiWB植原体与榆树黄化组(Elm yellows group,16SrⅤ)成员的16S rDNA序列相似性都在98%以上,而与其它组成员相似性低于97.5%;与枣疯病(JWB)植原体的SR序列相似性在99%以上;与已测定的丝瓜丛枝病植原体(16SrⅧ)的23S rDNA序列相似性最高,为94%;与河南JWB植原体tuf基因的序列相似性达99.9%;rp基因与16SrⅤ组其中另外三个成员的相似性都在95%以上。从而确定三个地区BiWB植原体归属于榆树黄化组,与我国发生JWB、樱桃致死性黄化和黄槐丛枝病的植原体为同一组的成员,未检测到过去根据PCR-RFLP分析结果鉴定出的三叶草簇生组(Clover proliferation group,16SrⅥ)植原体的存在。针对重阳木植株中可能存在的对PCR有影响的物质,及此植原体基因组与泡桐丛枝病(PaWB)植原体等16SrⅠ成员差异明显的特点,本研究对DNA提取方法和PCR的条件进行了一系列的摸索和改进,建立了优化的实验条件,包括在DNA提取过程中去掉叶肉、选用组培病苗等,进行PCR时对模板DNA稀释、选择最佳退火温度等。并且发现不同组植原体间、不同基因间的G+C含量与比率有明显的差异,这种差异可能会影响PCR扩增的条件。进一步用BiWB植原体与我国发生PaWB、JWB、长春花绿变病(PV)、苦楝丛枝病(CBWB)的重要植原体进行了部分DNA比较,包括23S rRNA基因的序列分析与RFLP、染色质外DNA的扩增与产物的RFLP分析、Southern bloting以及几个地区PaWB植原体的变异分析。结果验证了BiWB植原体作为16SrⅤ组成员的地位;进一步肯定了PV植原体和CBWB植原体被划为16SrⅠ组成员是恰当的。所鉴定的与叶酸合成相关的基因folP在PaWB、BiWB、PV和CBWB植原体中编码FolP蛋白,未发现三叶草簇生植原体等的叶酸合成功能丧失的假基因ΨfolP,四者的序列相似性都在98%以上。本研究对BiWB植原体进行了分子鉴定,初步研究了它与其它植原体的系统进化关系和分子差异;建立了BiWB植原体快速准确的检测、鉴定与鉴别的技术体系;为这些植原体的科学分类和命名、病原基因组学和功能基因组学研究、亚组及变异分析、病原检测、病害检疫、流行学研究及病害的治理等都奠定了良好基础。
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