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表观遗传标记的变化是决定干细胞命运和分化的重要调控因素。在过去的几年里,表观遗传调控干细胞生物学的研究主要集中在胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)。然而,对表观遗传调控成体干细胞生物学过程的理解却很有限。间充质干细胞(Mensenchymal stem cells,MSCs)是研究最多的成体干细胞群体,但是对调节间充质干细胞的分化状态和特性的分子机制的研究仍不成熟。由于脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)取材容易、来源广泛,成为近些年理论研究和临床应用的首选材料。本研究以特色优质阿尔巴斯绒山羊的脂肪间充质干细胞作为研究对象,使用表观遗传试剂氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)和地西他滨(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)体外改变脂肪间充质干细胞的表观遗传修饰,研究DNA去甲基化对脂肪间充质干细胞的特性和功能的调控作用,以便丰富表观遗传调控干细胞分化的内容,为理解干细胞特性和功能的分子机制提供实验依据。一、表观遗传试剂对阿尔巴斯绒山羊脂肪间充质干细胞生长的影响本研究通过细胞计数法、MTT法和流式细胞周期和凋亡检测的结合发现,以半抑制浓度培养细胞24h时,虽然细胞周期阻断在G0/G1期,但细胞凋亡数目较少,活性最强。二、表观遗传试剂对阿尔巴斯绒山羊脂肪间充质干细胞去甲基化作用我们使用半抑制浓度的5-Aza和5-Aza-dC分别培养细胞24h,提取5-Aza和5-Aza-dC处理后的gADSCs基因组,检测发现DNA甲基化水平降低,然而羟甲基化水平升高。5-Aza和5-Aza-dC对基因转录水平的影响是一致的,都引起DNMT1和DNMT3B基因转录抑制,DNMT3A、TET1、TET2和TET3基因转录升高。蛋白质水平上,gADSCs在5-Aza处理下,DNMT1表达量下降,TET1和TET3表达升高;5-Aza-dC处理后,虽然没有抑制DNMT1表达,但是TET1、TET2和TET3蛋白表达升高。结果表明,虽然5-Aza和5-Aza-dC的作用机制略有不同,但是都引起了 TET家族促进5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶发生转换,基因组DNA发生很大程度的去甲基化。三、DNA去甲基化对细胞增殖、凋亡和多能性相关基因表达的影响细胞免疫荧光、实时定量PCR和蛋白质免疫印迹检测5-Aza和5-Aza-dC处理前后的gADSCs中,增殖相关基因TERT和PCNA,凋亡相关基因P53和BAX和多能性相关基因Nanog、Oct4和Sox2的转录和表达的情况。研究发现,5-Aza和5-Aza-dC处理后的细胞中,Oct4、Sox2、TERT、PCNA和P53的转录水平均降低;在5-Aza处理后的细胞中,Nanog的转录水平升高,BAX的转录水平降低;在5-Aza-dC处理后的细胞中,Nanog的转录水平降低,BAX的转录水平升高。进一步地,5-Aza和5-Aza-dC处理提高了 Sox2的表达,降低了 PCNA的表达,而BAX的表达升高。Nanog、Oct4、TERT和P53基因表达没有变化。结果表明,基因组去甲基化改变了增殖、凋亡和多能性相关基因的转录水平。干细胞多能性的提高依赖于Sox2表达提高。四、DNA去甲基化对gADSCs向三胚层分化的影响通过检测处理前后诱导形成的脂肪细胞分泌的脂滴含量和脂肪细胞特异性因子PPARG、Adipod、Fabp4和Leptin转录水平,发现处理后脂肪细胞的脂滴产量增加,PPARG转录水平降低,Adipod、Fabp4和Leptin转录水平升高。ELISA检测5-Aza和5-Aza-dC处理前后gADSCs分化形成的神经细胞中NGF含量,发现其含量增加。实时定量PCR结果显示,处理后分化的神经细胞中EN02和RBFOX3转录水平升高。通过检测5-Aza和5-Aza-dC处理前后gADSCs分化形成的肝脏细胞中ALB和尿素含量、AFP转录水平,发现处理后ALB和尿素含量增加、AFP转录水平升高。这些结果表明,5-Aza和5-Aza-dC处理促进了gADSCs向脂肪细胞、神经细胞和肝脏细胞分化。五、DNA去甲基化对PPARG、RBFOX3和HNF4A启动子甲基化水平的影响实时定量PCR检测发现,分化前5-Aza和5-Aza-dC改变了脂肪细胞、神经细胞、肝脏细胞分化相关的转录因子PPARG、RBOXF3和HNF4A的转录水平。亚硫酸氢盐测序检测PPARG、RBOXF3和HNF4A启动子区域的甲基化水平发生改变。PPARG启动子区域第81位CpG去甲基化位点、RBFOX3启动子区域第8、20、44、70、174和181位CpG甲基化位点和HNF4A启动子区域的4个CpG去甲基化位点对PPARG、RBFOX3和HNF4A的转录调控具有重要作用。综上研究得出,5-Aza和5-Aza-dC引起TET家族高表达促进5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶发生转换,基因组DNA发生去甲基化;去甲基化使得不同基因的转录水平发生改变,但是却依赖Sox2基因调控网络促进gADSCs干细胞特性;基因组去甲基化改变了脂肪细胞、神经细胞、肝脏细胞分化相关的转录因子PPARG、RBOXF3和HNF4A的启动子区域部分CpG位点的甲基化状态;去甲基化促进gADSCs向脂肪细胞、神经细胞和肝脏细胞体外分化。